利用味精廢水培養枯草芽孢桿菌產γ-聚谷氨酸及初步表征

張彥麗

山東行政學院，山東 濟南 250014

味精廢水是生產味精時由谷氨酸發酵液提取谷氨酸后產生的廢液，以及生產過程中的洗滌廢水。它是一種高濃度有機廢水，具有酸性強、高COD、高 BOD、高硫酸根、高菌體含量和低溫等特點，處理難度很大，處理成本較高。味精廢水的治理已經成為制約味精生產企業發展的重大難題（于信令，1995；喻軼等，2017）。味精廢水中含有大量的 L-谷氨酸、還原糖與氨氮，如果任其排放不僅會造成嚴重的環境污染，而且浪費了寶貴資源。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid；γ-PGA）是一種通過微生物合成的均聚氨基酸化合物，具有生物可降解性、生物相容性、可食用、對人體和環境無毒害等優點。因此，γ-聚谷氨酸被廣泛應用于藥物工業、食品工業、化妝品工業、生物材料及污水處理中，是一種應用前景廣泛的高分子材料（Shih et al.，2001；王衛國等，2016；彭偉等，2017）。γ-PGA的生產方法包括：化學合成法、酶轉化法、提取法和微生物發酵法（孫先林等，2012）。自1942年Bovarnick（1942）發現芽孢桿菌能夠在培養基中積累γ-PGA以來，對于利用微生物法合成γ-PGA的研究就十分活躍。γ-PGA生產菌株主要是芽孢桿菌屬（張宸，2018），包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）（Goto et al.，1992；Kubotah et al.，1993；Ogawa et al.，1997；Yoshihito et al.，1996）、炭疽芽孢桿菌（B. anthracis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）（Cromwick et al.，1995）和解淀粉芽孢桿菌（B. anmloliquefaciens）（邵麗等，2007）。與化學合成法、酶轉化法和提取法相比，微生物發酵法生產γ-PGA具有培養條件溫和、生產過程容易控制、γ-PGA分子量適宜、提取率高、環境友好等優點，已經成為國內外學者和專家關注和研究的熱點，是當前具有工業化前景的γ-PGA生產方法，但由于微生物的γ-PGA合成代謝途徑較為復雜，培養周期較長，以標準培養基通過微生物法合成 γ-聚谷氨酸成本較高，制約了其大規模生產和工業化應用。

本研究從降低γ-聚谷氨酸生產成本和實現味精廢水綜合利用的角度出發，以味精廢水為發酵培養基，培養枯草芽孢桿菌合成γ-聚谷氨酸，考察味精廢水濃度、發酵培養初始 pH、枯草芽孢桿菌接種量和發酵培養時間對菌體生長和 γ-PGA產量的影響；以提高γ-PGA產量為目標，采用響應面法中的Box-Behnken模型設計實驗，擬合二次回歸模型，優化培養條件；測定粗產品中γ-PGA的含量，通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振對發酵合成的γ-PGA粗品進行分析表征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

味精廢水取自山東省某味精生產企業，為高濃度的谷氨酸發酵廢液，廢水水質指標參照《水與廢水分析監測方法》（第4版）測定，結果如表1所示。實驗試劑有常用的水質分析化學試劑、生化試劑和茚三酮、谷氨酸標準品、甲醇、氯仿（三氯甲烷）等。

表1 味精廢水水質特征Table1 Characteristics of the monosodium glutamate wastewater

1.2 菌種活化及種子培養

本實驗所用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis-168），山東大學環境學院微生物實驗室冷凍保藏（-70 ℃），由山東大學環境科學與工程學院李力教授惠贈。冷凍的枯草芽孢桿菌從-70 ℃依次轉移至-20 ℃、4 ℃進行活化，平板劃線后置于37 ℃培養箱中培養24 h。平板培養基為LB固體培養基。

種子培養基為LB液體培養基。從平板上取1～2環枯草牙孢桿菌接入種子培養基中，250 mL三角瓶的裝液量為30 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下培養12 h。所有培養基均經濕熱高壓滅菌后使用，滅菌條件：121 ℃，0.1 MPa，20 min。

1.3 以味精廢水為培養基搖瓶發酵培養

將微生物種子液按 3%～16%（V/V）的接種量接入1～10倍稀釋的味精廢水發酵培養基中，300 mL三角瓶中味精廢水的裝液量為50 mL，在37 ℃、180 r·min-1的條件下培養一定時間。

1.4 生物量的測定

發酵菌懸液的生物量可用其在特定波長處的吸光度（OD）來表示。將發酵液稀釋后用紫外-可見分光光度計（PGENERAL TU1810，China）于660 nm讀取菌懸液的OD660nm。

取 20 mL發酵液于已預先稱重的干燥離心管中，10000 r·min-1離心 10 min，上清液用于γ-PGA的分離提純，菌體用超純水洗滌3次，于80 ℃烘箱中烘至恒重，總質量減去空管質量即為菌體凈干重（Shi et al.，2006）。

1.5 γ-PGA的分離提取

將發酵液進行高速離心（10000 r·min-1，10 min）除菌，取2 mL上清液于預先稱重離心管（10 mL）中，加入8 mL無水乙醇沉淀出產物，將含產物的離心管反復烘干至恒質量，減去離心管的質量即得到粗產品干質量（g·L-1）。

1.6 γ-PGA含量的測定

在一定的pH條件下氨基酸與茚三酮共熱可生成藍紫色化合物，其顏色的深淺與氨基酸含量有關，可用于比色定量，因此可采用茚三酮比色法來測定谷氨酸的含量（Wang et al.，2005）。

1.7 γ-PGA的紫外光譜、紅外光譜和核磁共振表征

用紫外-可見分光光度計（PGENERAL TU1810，China）在190～600 nm范圍內掃描經去離子水溶解的γ-PGA粗產品溶液。

由乙醇沉淀法提取得到的微生物絮凝劑γ-PGA經干燥處理后，進行傅立葉紅外光譜和核磁共振分析。將2 mg微生物絮凝劑樣品與200 mg純KBr研細混勻，置于模具中，壓成透明薄片（樣品和KBr都要進行干燥處理，且研磨粒度須小于2 μm，以避免散射光的影響）。用紅外光譜儀（Nicolet Avatar 370，US）在室溫下對樣品進行紅外光譜測定，并設定分辨率為2 cm-1，掃描范圍為4000～400 cm-1。采用核磁共振波譜儀（Bruker Av-300，Switzerland）分析γ-PGA的結構，以D2O為溶劑溶解樣品，在測定溫度為300 K、脈沖寬度為13.8 μs、延遲時間為2 s和掃描次數為8的條件下采集試樣氫譜。

2 結果與討論

2.1 發酵培養單因素實驗

微生物在培養基中的生長情況與培養基組成、發酵培養條件密切相關。目前有關在標準培養基中培養枯草芽孢桿菌生產 γ-PGA的培養條件研究較為成熟，一般控制溫度為 37 ℃，搖瓶轉速為 180 r·min-1時有利于枯草芽孢桿菌的生長和 γ-PGA 產量的提高。以味精廢水代替標準培養基培養枯草芽孢桿菌 168，采用單因素控制實驗重點研究味精廢水濃度、培養初始 pH、接種量和培養時間對枯草芽孢桿菌生長和γ-PGA產量（以粗產品干重表示）的影響。在研究其中一個因素對枯草芽孢桿菌的生長和γ-PGA產量的影響時，其他3個因素的條件參考正交預實驗結果確定。

2.1.1 味精廢水濃度對枯草芽孢桿菌生長及γ-PGA產量的影響

實驗中固定味精廢水初始 pH為 6.0，接種量10 mL，在 37 ℃、180 r·min-1條件下發酵培養 48 h，將味精廢水稀釋至一定倍數，通過單因素控制實驗考察稀釋倍數（1-不稀釋、2、4、6、8、10）對枯草芽孢桿菌生長情況（以生物量和上清液特征吸光度表示）和γ-PGA產量的影響，實驗結果如圖1(a)所示。

味精廢水的濃度對枯草芽孢桿菌的生長和γ-PGA的產量均有較大影響。在低濃度的味精廢水中，營養物質濃度不足是影響枯草芽孢桿菌生長和γ-PGA產量的主要因素；但是味精廢水的濃度過高（原水經不稀釋）時，較高的SO42-濃度會抑制微生物的生長（Wang et al.，2004），不利于γ-PGA的生物合成。在廢水處理的厭氧消化系統中，當 SO42-濃度為4000 mg·L-1時，會對厭氧系統產生嚴重的抑制作用（Wang et al.，1995）。本實驗中，味精廢水的SO42-濃度為15.26 g·L-1（表1），實驗結果表明，在好氧發酵的情況下，如果不經稀釋，SO42-對枯草芽孢桿菌生長和 γ-PGA產量產生較大抑制作用。當味精廢水稀釋2倍時，發酵液的生物量達到最高值，但是γ-PGA的產量卻未達到最高值，而是在4倍稀釋的味精廢水中（SO42-濃度低于4000 mg·L-1）γ-PGA具有最高產量，顯示了γ-PGA的合成與枯草芽孢桿菌的生長不同步，在較高的生物量情況下并未對應最高的 γ-PGA產量，說明過高的SO42-濃度對γ-PGA合成過程抑制作用較強。

2.1.2 味精廢水初始pH對枯草芽孢桿菌生長及γ-PGA產量的影響

圖1 （a）味精廢水濃度、（b）培養基初始pH、（c）接種量、（d）培養時間對發酵液生物量Biomass、上清液特征吸光度OD660 nm和γ-PGA產量的影響Fig. 1 Effects of (a) initial MSGW concentration, (b) initial culture pH, (c) inoculation concentration, (d) cultivation time on biomass, OD 660 nm,and γ-PGA production

調節味精廢水（4倍稀釋）初始的pH值分別為3.0～8.0，接種10 mL枯草芽孢桿菌，在37 ℃、180 r·min-1條件下發酵培養48 h，以考察pH值對枯草芽孢桿菌生長和γ-PGA產量的影響，實驗結果如圖1(b)所示。培養基初始pH對微生物的生長和γ-PGA的生物合成具有很大的影響，過低和過高的初始pH均不利于枯草芽孢桿菌的生長和γ-PGA的積累。此外，在枯草芽孢桿菌的發酵培養過程中，pH是逐漸升高的，以初始pH=6.0為例，在開始培養6、24和48 h后，發酵液的pH分別為6.3、7.2和7.9。所以，相對較低的初始pH（pH=6）有利于枯草芽孢桿菌的生長和γ-PGA的合成。

2.1.3 接種量對枯草芽孢桿菌生長及γ-PGA產量的影響

考慮到采用高濃度的味精廢水作為培養基，本著工藝簡單、高效利用味精廢水的原則，實驗設計中枯草芽孢桿菌接種量取較高水平 4～14 mL，即7%～21%（V/V）。其他培養條件為：味精廢水 4倍稀釋，培養初始pH=6，在37 ℃、180 r·min-1條件下發酵培養48 h，實驗結果如圖1(c)所示。由圖可知，當枯草芽孢桿菌接種量為4～10 mL時，發酵液生物量和上清液特征吸光度OD660nm均隨接種量的增加而增大，當接種量大于10 mL時趨于穩定。而γ-PGA產量隨著接種量的增加先增大（接種量4～10 mL）而后出現下降趨勢（10～14 mL），并在接種量為 10 mL 時達到最大值(49.33±1.21) g·L-1。

在低接種量的情況下，味精廢水培養基中營養豐富，導致枯草芽孢桿菌菌體迅猛生長，影響到γ-PGA的合成、積累。而當接種量過高時，又會導致培養基中的營養相對不足，枯草芽孢桿菌菌體生長消耗較多營養，發酵培養后期菌體處于饑餓狀態，從而也影響到γ-PGA的合成與積累。所以，就4倍稀釋味精廢水而言，適度的接種量（10 mL）有利于菌體生長和γ-PGA的積累。

2.1.4 培養時間對枯草芽孢桿菌生長及γ-PGA產量的影響

微生物的生長和γ-PGA的產量還受到培養時間的影響，調節4倍稀釋味精廢水的初始pH為6.0，接種量為10 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下發酵培養72 h，繪制枯草芽孢桿菌的發酵進程曲線（圖1(d)），以確定最佳發酵培養時間。

由圖1(d)可知，培養時間-γ-PGA的產量曲線可分為以下3個階段：第1階段為0～18 h，γ-PGA的產量隨時間的延長而緩慢增加，這是由于發酵培養初期微生物需要一段時間適應、菌體增殖。第2階段為 18～48 h，此時發酵液中已生長增殖了一定量的菌體，γ-PGA的產量隨時間的延長而大幅增加，為快速增長階段。第3階段為48～72 h，此時，γ-PGA產量隨時間的延長不再明顯增長，曲線趨于平緩。而發酵液生物量和上清液特征吸光度OD660nm的時間曲線的變化趨勢與γ-PGA產量的時間曲線相似，只是快速增長階段有所提前（12～24 h）。顯然，當以提高γ-PGA產量為目標時，48 h是利用味精廢水培養枯草芽孢桿菌產γ-PGA的適當培養時間。

2.2 響應面法優化培養條件

響應面法（Response Surface Methodology，RSM）是解決多變量問題的一種統計方法（謝麗丹等，2017）。本實驗采用 Box-Behnken響應面設計對培養條件進行優化。根據Box-Behnken設計原理（Box et al.，1960），用 Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗，對結果進行分析，建立二次回歸方程，并預測、驗證枯草芽孢桿菌168菌株產γ-PGA的最佳培養條件。

2.2.1 Box-Behnken 實驗設計及結果

根據單因素實驗結果，以最大產量區進行Box-Behnken設計，以味精廢水稀釋倍數、培養基初始pH和接種量3個因素為自變量，γ-PGA產率為響應值，三因素三水平的響應面設計和實驗結果如表2、表3所示。

表2 Box-Behnken設計中的因子與水平Table 2 Factors and level in BBD

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results of BBD

2.2.2 二次回歸模型擬合及方差分析

用Design-Expert 8.0.6軟件對15個實驗點的響應值進行回歸分析和方差分析，結果如表 4、表 5所示。分別以A、B、C表示味精廢水稀釋倍數、培養基初始 pH和接種量。擬合得到 γ-PGA產量 P（g·L-1）的回歸方程為：P=49.45+0.14X1-0.47X2+3.37X3+2.14X1X2-0.41X1X3-0.86X2X3-4.29X12-3.95X22-2.28X32。

表4 回歸模型及系數估計Table 4 Regression model and the coefficient estimates

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

從回歸方程和部分重復因子實驗的回歸分析及方差分析結果（表 4、表 5）可以看出，回歸模型顯著性檢驗的P值為0.0001，說明所得回歸方程的可信度較高，具有很好的代表性。此外由模型的可信度分析（表5）得到復相關系數r2=0.9909，校正后r2=0.9746，說明模型可以解釋99.09%實驗所得的γ-PGA產量的變化，同時也說明該模型方程適用于本實驗利用味精廢水培養枯草芽孢桿菌生產γ-PGA產量的理論預測。另外，響應值的變異系數CV較小（為1.52），進一步說明了該回歸模型的可信度較高。表5中，C、AB、BC、A2、B2和C2的P值小于 0.05，說明 C、AB、BC、A2、B2和 C2對響應值都有極顯著的影響。

2.2.3 響應面分析直觀圖

根據表3所示實驗結果和回歸方程，用Design-Expert 8.0.6軟件繪出味精廢水稀釋倍數、培養初始pH和接種量3個因素中任意兩個因素對γ-PGA產量的響應面分析圖和等高線圖，結果分別見圖 2、圖 3、圖 4。每個響應面分別代表兩個獨立變量之間的相互作用。由響應面和相應的等高線圖可以看出，兩兩因素之間的相互作用都比較明顯。

2.2.4 γ-PGA產量預測及培養條件優化

為了進一步確定γ-PGA最大產量的穩定點，對2.2.2中得到的回歸方程求一階偏導并使其等于零，可求得回歸方程的極值點為：味精廢水稀釋倍數A=3.88，培養初始pH B=5.84，接種量C=10.55 mL；代入回歸方程解得預測的 γ-PGA產量為 54.78 g·L-1。以響應面實驗得到的最佳培養條件進行發酵實驗，實驗重復3次，最后測得γ-PGA產量平均值為(53.51±0.92) g·L-1。實驗值與預測值相差較小，說明該模型能較好地預測實際發酵情況。通過優化，使得γ-PGA產量較單因素實驗產量(49.33±1.21)g·L-1提高了約 8.5%。

圖2 味精廢水稀釋倍數（A）與培養初始pH（B）對γ-PGA產量的響應面分析圖與等高線圖Fig. 2 Response surface plot and contour plot for the effects of Dilution fold of MSGW (A) and Initial culture pH (B) on γ-PGA production

圖3 味精廢水稀釋倍數（A）與接種量（C）對γ-PGA產量的響應面分析圖與等高線圖Fig. 3 Response surface plot and contour plot for the effects of Dilution fold of MSGW (A) and Inoculation volume (C) on γ-PGA production

圖4 培養初始pH（B）與接種量（C）對γ-PGA產量的響應面分析圖與等高線圖Fig. 4 Response surface plot and contour plot for the effects of Initial culture pH (B) and Inoculation volume (C) on γ-PGA production

根據文獻報道，多株菌種曾被用于γ-PGA的生產，Ogawa et al.（1997）在40 ℃條件下培養地衣芽孢桿菌（B. licheniformis ATCC9945a）生產γ-PGA，其產量達到 35 g·L-1。Kubota et al.（2008）在 37 ℃條件下培養枯草芽孢桿菌菌株B. subtilis F201生產γ-PGA，產量達到 50 g·L-1。Shi et al.（2006）對枯草芽孢桿菌菌株B. subtilis ZJU-7生產γ-PGA的培養基條件進行了優化，優化后的培養基為：蔗糖59.80 g·L-1，蛋白胨 53.54 g·L-1，L-谷氨酸 81.05 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，此時，γ-PGA 產量為 58 g·L-1（Shi et al.，2006）。本實驗采用味精廢水作為枯草芽孢桿菌168的培養基，在3.88倍稀釋的味精廢水中，控制初始pH為5.84，以較高的菌種投加量（每50 mL味精廢水投加10.55 mL種子液），可以達到較高的γ-PGA產率，且不需另加碳源和氮源，具有降低生物法合成γ-PGA成本的潛力。所以，以味精廢水培養枯草芽孢桿菌168生產γ-PGA是可行的，具有較大的開發潛力。

2.3 γ-PGA的含量及表征

2.3.1 γ-PGA含量的測定

采用茚三酮比色法測定γ-PGA粗產品的純度，結果如表6所示，以光密度D570為自變量、谷氨酸的質量（y）為因變量求得標準曲線為：

y=2007.5 D570-53.048，r2=0.9992

由表 6求得待測樣品的平均光密度為 0.650，根據標準曲線計算出樣品水解液中谷氨酸的質量為1251.83 μg，而測定的樣品水解液中樣品（γ-PGA粗產品）的質量為1600 μg，所以γ-PGA粗產品中γ-PGA的含量為78.24%。

表6 各組溶液中谷氨酸含量及其在570 nm處的光密度Table 6 Glutamic acid content in the solutions and its optical density at 570 nm

2.3.2 γ-PGA紫外光譜掃描

γ-PGA粗產品溶液的紫外掃描光譜如圖 5所示：曲線為平滑曲線，且只出現一個峰，最大吸收波長位于215 nm處，與γ-PGA 的特征紫外吸收波長非常接近（216 nm）（Cromwick et al.，2015）。由于蛋白質在280 nm有特征吸收峰，核酸在260 nm有特征吸收峰，而樣品在260～280 nm處沒有吸收峰，說明γ-PGA的聚合鍵與蛋白質的肽鍵結構有明顯區別。從谷氨酸氨基和羧基的特點說明γ-PGA是由γ-酰胺鍵聚合而成。

圖5 γ-PGA的紫外掃描圖譜Fig. 5 Ultra Violet scanning spectrum of γ-PGA

2.3.3 γ-PGA紅外光譜（FTIR）分析

聚谷氨酸中含有酰胺基、羧基和羰基等多種有機官能團，具有很多特征吸收峰，采用紅外光譜法可以對γ-PGA的結構進行初步的鑒定。由圖6可知，γ-PGA的紅外圖譜中存在4個酰胺吸收帶：3386.63 cm-1處存在一個寬大強吸收峰，該吸收峰為N—H對稱伸縮振動帶（于曉丹，2011）（酰胺吸收帶I），由于分子間的締合作用使得該峰寬度比較大；1643.90 cm-1處出現的吸收峰為 C=O的伸縮振動（酰胺吸收帶II）；1534.32 cm-1處出現的吸收峰是由N—H彎曲振動和C—N平面搖擺振動締合（酰胺吸收帶III）而成的；1125.93 cm-1處的吸收峰為C—N伸縮振動（酰胺吸收帶IV）產生的，由這4個吸收峰結合證明該物質中存在酰胺基。

圖6 γ-PGA的紅外光譜圖Fig. 6 Infrared spectra of γ-PGA

在 3100～2900 cm-1之間存在吸收峰 3068.42 cm-1和2932.55 cm-1，說明該化合物中存在飽和的C—H的對稱伸縮振動和不對稱伸縮振動，即存在—CH2—基團。1399.37 cm-1處的吸收峰是由—OH彎曲振動產生的，而1047.47 cm-1處的吸收峰則是由 C—O伸縮振動產生的，由這兩者結合上述1643.90 cm-1處的C=O伸縮振動產生的吸收峰，可以推測聚合物中含有—COOH基團。而在低頻區1000～500 cm-1處的吸收峰則是由(CH2)n（n＞4）面外扭曲振動和平面搖擺振動產生的，由于N—H非平面彎曲振動使其吸收峰增寬（于曉丹，2011）。通過上述的圖譜分析，可以發現聚合物中含有酰胺基、羧基和亞甲基，可以初步確定樣品中存在γ-PGA結構。

2.3.4 γ-PGA核磁共振(NMR)分析

圖7 γ-PGA的1H NMR圖譜Fig. 7 1H NMR spectra of γ-PGA

圖7所示為γ-PGA樣品的1HNMR圖譜。樣品在化學位移0～10之間存在6個不同類型的質子。根據質子的化學位移范圍可以推測 δ=7.989處為—NH特征峰，由于—NH、—OH等基團的質子氫較為活潑，在溶劑（D2O）中交換很快，并受測定條件（如溫度、濃度及溶劑等）的影響，化學位移值并不是一個固定的值，即使待測樣品用D2O溶液浸潤后立即測定，由于質子交換作用，—NH的質子峰面積仍較小，且因氮原子與鄰近碳原子上的質子的去耦合作用而呈現單吸收峰；—OH質子的吸收峰消失；而δ=4.052處HDO的峰面積則較高。化學位移δ=3.569處的質子可推測為—CH結構，而化學位移 δ=2.263處 2個質子的單峰可推測為—CH2結構，—CH質子與—CH2發生質子耦合而分裂成雙峰 δ=1.990和δ=1.885。此外根據質子的化學位移范圍還可推測化學位移 δ=1.069處為—CONH結構（于曉丹，2011）。經過分析，1H NMR圖譜中各峰歸宿如表7所示。結合紅外分析結果，可以確定樣品中γ-PGA的結構為（于曉丹，2011；萬紅貴等，2004）：

表7 γ-PGA樣品的1H NMR圖譜各峰歸宿Table7 Peak results of γ-PGA 1H NMR spectra

3 結論

（1）利用味精廢水培養枯草芽孢桿菌 168產γ-PGA時，味精廢水濃度、初始pH、接種量和培養時間對枯草芽孢桿菌168的生長和γ-PGA產量具有重要的影響。BBD響應面正交實驗優化后的培養條件為：味精廢水稀釋倍數 3.88，培養初始pH 5.84，50 mL味精廢水接種量 10.55 mL，在37 ℃、180 r·min-1條件下培養 48 h，γ-PGA 的產量達到(53.51±0.92) g·L-1。利用味精廢水作為枯草芽孢桿菌 168的培養基，可以達到較高的 γ-PGA產率，且不需另加碳源和氮源，具有降低微生物發酵法合成γ-PGA的潛力。

（2）采用茚三酮比色法測定γ-PGA粗產品純度為78.24%。紫外掃描光譜顯示γ-PGA的聚合鍵與蛋白質的肽鍵結構有明顯區別，γ-PGA是由γ-酰胺鍵聚合而成。傅立葉紅外光譜和核磁共振分析顯示樣品中含有酰胺基、羧基、羰基—CH、—CH2等基團，可確定為γ-PGA的結構。