假肥大型肌營養(yǎng)不良患兒的血清酶學與基因特征分析

黃彩芝 張聰 李愛國 莫麗亞

湖南省兒童醫(yī)院檢驗中心（長沙 410007）

假肥大型肌營養(yǎng)不良（pseudohypertrophic mus?cular dystrophy）是進行性肌營養(yǎng)不良中最常見的一種嚴重神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病，為X連鎖隱性遺傳病，其病理改變是抗肌萎縮蛋白基因缺失或突變而致肌纖維膜上的抗肌萎縮蛋白表達缺乏，導致肌纖維進行性變性壞死［1-3］。根據(jù)抗肌萎縮蛋白表達缺乏的程度，可將該病分為Duchenne肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和Becker肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）兩種表型，臨床上最常見的假肥大型肌營養(yǎng)不良是DMD［4］。目前國內(nèi)外對DMD/BMD雖無有效的治療方法，但早期準確識別該病并采取適當?shù)母深A措施可延緩病情、延長患兒生命，提高生存質(zhì)量［5］。本研究通過對118例DMD/BMD患兒的血清酶學與基因特征進行分析，旨在提高對本病的早期認識及診斷水平。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月至2016年12月在我院臨床診斷為DMD/BMD并要求基因診斷的118例患兒作為研究對象。DMD/BMD的臨床診斷根據(jù)《兒科學》第七版關于假肥大型肌營養(yǎng)不良的診斷標準［6］，并排除其他常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病與遺傳代謝性肌病。隨機選取同期在我院兒童保健科體檢的健康男性兒童40例作為正常對照組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準，入選患兒均征得監(jiān)護人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和處理 所有研究對象清晨空腹抽取靜脈血4.0 mL，其中2.0 mL EDTA?K2抗凝血提取DNA用于基因檢測，另2.0 mL未抗凝血分離血清用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotrans?feras，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate ami?notransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactic dehydroge?nase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK?MB）、肌紅蛋白（myoglobin，MB）、羥丁酸脫氫酶（hydroxybu?tyrate dehydrogenase，HBDH）等酶學檢測。基因檢測3周內(nèi)完成，其余各項指標檢測均在采血后2 h內(nèi)完成。

1.2.2 血清酶學檢測 采用速率法檢測血清ALT、AST、LDH、CK、HBDH，免疫抑制法檢測CK?MB，膠乳免疫比濁法檢測MB，所用儀器為美國西門子2400全自動生化分析儀，試劑由上海科華生物工程股份有限公司提供（ALT批號2014036Q、2015072Q；AST批號2014022Q、2015012Q；LDH批號2014062Q、2015121Q；CK批號20141012、0150912；HBDH 批 號 20130918、16051102；CK?MB 批號20140222、20151212；MB批號20131212、160510），由專人嚴格按操作規(guī)程進行操作，所有項目質(zhì)控合格，儀器狀態(tài)正常。酶學指標異常標準：ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、LDH＞450 U/L、CK＞174 U/L、CK?MB＞24 U/L、MB＞90 ng/mL、HBDH＞182 U/L。

1.2.3 基因檢測 采用多重連接酶依賴探針擴增（multiplex ligation?dependent probe amplification，MLPA）技術（試劑為荷蘭SALSA公司生產(chǎn)的P034型和P035型試劑盒）檢測待檢樣本DMD基因的79個外顯子，用正常DNA作為參照，從而檢測DMD基因是否發(fā)生缺失或重復突變。當檢測到單個外顯子缺失時，進一步應用PCR技術、基因測序技術進行驗證。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）［M（P25～P75）］表示，組間比較采用 Mann?WhitneyU非參數(shù)秩和檢驗。采用ROC曲線法評價ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH對DMD/BMD患兒基因診斷的預測能力，以約登指數(shù)（Youden′s index）最大時的臨界值作為截斷值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 118例DMD/BMD患兒均為男性，最大年齡133個月，最小1個月；其中學齡前患兒（＜72月）82例，學齡期患兒（≥ 72月）36例。118例患兒中52例（44.07%）具有明顯臨床癥狀與體征，包括雙下肢或四肢乏力，行走緩慢，易跌倒，呈鴨步，跑步及爬樓梯困難，Gowers征陽性，可見翼狀肩、腓腸肌肥大等，其中14例有肌營養(yǎng)不良家族史；66例（55.93%）暫無明顯臨床表現(xiàn)患兒中僅1例有家族史。所有患兒行肌電圖檢查，結(jié)果均提示“肌源性病損電生理改變”。1例行腓腸肌活檢，結(jié)果提示“肌纖維結(jié)構部分清楚，可見橫紋結(jié)構，未見脂肪變性或糖原性空泡改變，未見明顯炎細胞浸潤，部分肌束明顯變圓，肌細胞橫紋消失”。

2.2 血清酶學檢測結(jié)果 DMD/BMD患兒的血清酶學結(jié)果明顯高于正常對照組兒童，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜ 0.001），ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH最高水平分別達正常上限19倍、17倍、12倍、150倍、35倍、32倍、12倍。見表1。

表1 DMD/BMD患兒與正常兒童的血清酶學比較Tab.1 serum enzymes comparison between DMD/BMD group and control group M（P25～P75）

學齡前患兒的CK和CK?MB水平明顯高于學齡期患兒（均P＜0.01），而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH水平在兩組患兒中的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 學齡前患兒與學齡期患兒的血清酶學比較Tab.2 serum enzymes comparison between preschool group and school age group M（P25～P75）

2.3 基因檢測結(jié)果 118例臨床診斷DMD/BMD患兒采用MLPA檢測DMD基因，陽性結(jié)果91例，檢出率77.12%，74例（81.32%）檢出外顯子缺失，其中單個外顯子缺失17例，經(jīng)PCR驗證均無擴增條帶，提示確為相應外顯子缺失；17例（18.68%）檢出外顯子重復。缺失外顯子位于中央缺失熱區(qū)（44-52號外顯子）內(nèi)的檢出率為60.81%（45/74），位于5′端缺失熱區(qū)（2～20號外顯子）內(nèi)的檢出率為6.76%（5/74）。91例MLPA檢測陽性患兒中，發(fā)生小片段（＜5外顯子）缺失及重復突變44例（48.35%），發(fā)生大片段（＞30外顯子）缺失及重復突變8例（8.79%），最大可見連續(xù)63個外顯子缺失（17～79號外顯子缺失）。

27例MLPA檢測陰性的患兒中有8例接受基因測序檢查，其中6例檢出突變，分別為外顯子無義突變 4例：Ex75c.（10603_10622delinsTGATG）、Ex46c.（6677G＞A）、Ex63c.（9258delC）、Ex11c.（1201C＞T）；外顯子移碼突變1例：Ex10c.（1019delA）；內(nèi)含子剪接突變1例：Intr45c.（6614+1G＞C）。

2.4 ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，CK和CK?MB用于預測DMD/BMD患兒基因診斷陽性具有顯著統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），曲線下面積分別為0.74和0.69，CK＞2 178.85 U/L時診斷靈敏度為0.63，特異度為0.81，CK?MB ＞ 121.89 U/L時診斷靈敏度為 0.78，特異度為 0.52，而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH用于判斷DMD/BMD患兒基因診斷情況無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。CK和CK?MB兩者聯(lián)合應用（CK+CK?MB）時對DMD/BMD患兒基因診斷陽性預測的曲線下面積為0.79，靈敏度0.84，特異度0.62。見圖1。

3 討論

圖1 各檢測指標對DMD/BMD患兒基因診斷預測的ROC曲線Fig.1 ROC curves of the indexes in predicting gene diagnosis for DMD/BMD children

假肥大型肌營養(yǎng)不良（DMD/BMD）發(fā)病率為新生男嬰1/3 000～1/4 000，女性一般為攜帶者，2/3患兒的病變基因來自于母親，另有約1/3患兒為新發(fā)突變，與母親遺傳無關［7］。該病起病隱匿，早期不易察覺，多于3～5歲發(fā)病，初期可見動作笨拙，隨后逐漸出現(xiàn)上樓梯及蹲下后起立困難，鴨行步態(tài)等，體格檢查示肌肉萎縮明顯，呈進行性加重，以四肢近端肌，盆帶肌為著，腓腸肌假性肥大，隨病情緩慢進行性加重，逐漸臥床，多于20～30歲左右因呼吸衰竭或心功能不全而死亡。

研究發(fā)現(xiàn)DMD/BMD患兒血清CK明顯升高，同時 LDH、CK?MB、MB 均增高［8］，主要是由于DMD/BMD患兒抗肌萎縮蛋白缺陷導致肌纖維損傷壞死，大量CK、LDH、CK?MB、MB從肌細胞逸出進入血液所致。本組患兒的血清ALT、AST、LDH、CK、CK?MB、MB、HBDH水平均明顯升高，其中CK升高最明顯，最高值達正常上限的150倍，這是由于CK主要存在于體內(nèi)骨骼肌、心肌和平滑肌中，其中在骨骼肌中含量最高，而DMD/BMD患兒的骨骼肌和心肌均可受累，故血CK極度升高，此點有助于與其他型肌營養(yǎng)不良鑒別。學齡前患兒的CK和CK?MB水平明顯高于學齡期患兒，說明在病變早期肌纖維進行性損傷、壞死，酶快速釋放，CK值升高明顯，到疾病的中后期，大部分肌纖維已被破壞，纖維結(jié)締組織和脂肪組織浸潤受損的肌肉組織，正常肌纖維減少，CK活力逐漸下降，同時亦提示在DMD/BMD患兒起病早期心肌即可受累從而引起心肌細胞破壞、心肌萎縮和CK?MB水平升高［9］。本組有66例患兒無明顯臨床表現(xiàn)，其中41例在常規(guī)健康體檢時發(fā)現(xiàn)ALT與AST升高、25例因其它疾病治愈后血清CK仍異常升高而被進一步診斷為DMD/BMD，提示患兒可能在發(fā)病前期就已經(jīng)存在肌細胞的損害，因此臨床上對不明原因的血清酶學明顯升高應拓寬診斷思路警惕本病的可能，血清酶學指標可作為診斷DMD/BMD敏感的標志物，早期檢測可明顯減少該病的延遲診斷，在兒童健康監(jiān)測與疾病篩查中可作為常規(guī)檢測指標［10-11］。

DMD和BMD是同一DMD基因突變所致的不同臨床表現(xiàn)類型，DMD致病基因位于Xp21，該基因的突變率約1/10 000，遠高于其他基因的突變頻率；且突變形式多樣，外顯子缺失突變是主要的突變類型，其次為重復突變、點突變、小缺失及插入、剪切位點改變等，其中點突變多為無義突變［12］。本研究采用MLPA技術對118例臨床診斷DMD/BMD的患兒進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)91例（77.12%）患兒存在外顯子缺失或重復突變，60.81%（45/74）外顯子缺失突變集中在44～52號外顯子缺失熱點區(qū)域，與文獻報道基本一致［13］。MLPA檢測陽性患兒中，發(fā)生小片段缺失及重復突變的例數(shù)較多（44例），發(fā)生大片段缺失及重復突變的有8例，最大可見連續(xù)63個外顯子缺失。有27例患兒MLPA檢測結(jié)果呈陰性，可能是由于DMD基因發(fā)生了探針識別序列以外的微小改變，而MLPA技術的檢測局限性使其不能檢出基因點突變［14-15］，對這一部分患兒建議通過測序進行微小突變篩查，本研究中8例接受了基因測序檢查，其中6例檢出突變。

DMD/BMD基因診斷準確可靠，可明確致病基因，為遺傳咨詢與未來可能的基因治療提供了依據(jù)，但因其費用昂貴及設備技術要求高等原因限制了其在臨床上的應用。本研究中ROC結(jié)果表明，CK ＞2 178.85 U/L、CK?MB ＞121.89 U/L時對基因診斷陽性具有較高的預測能力，兩者聯(lián)合應用時對臨床診斷為DMD/BMD的患兒預測基因診斷陽性的曲線下面積為0.79，靈敏度0.84，特異度0.62，且血清酶學檢測對DMD/BMD篩查具有簡便快速、經(jīng)濟可行、依從性好的優(yōu)點，尤其在基層醫(yī)院極具應用價值，有利于減輕患兒家屬經(jīng)濟負擔并協(xié)助臨床醫(yī)師正確選擇診治方案。本研究的不足之處在于，仍有19例MLPA檢測結(jié)果呈陰性的患兒因未接受基因測序檢查而未能明確診斷，可能導致研究結(jié)果分析存在一定偏差，有待進一步的深入研究。