LAMP技術在涂陰肺結核中的臨床快速診斷價值

陳伊 黃文焰

深圳市寶安區慢性病防治院（廣東深圳 518102）

結核病是結核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，目前我國結核病的患病率形勢不容樂觀并呈現地區不平衡性［1］。涂陰肺結核由于痰涂片陰性，在現有的基層診療機構的常規結核診斷技術下，容易造成誤診漏診的情況發生，延誤患者的治療，因此如何更加準確、快速、簡便地診斷涂陰肺結核對于結核病的防治工作具有重要意義。

環介導等溫擴增技術（loop?mediated isothermal amplification，LAMP）是由 NOTOMI［2］等在 2010 年創建，是一種新型核酸檢測技術，該技術最大的特點是不需要像傳統的PCR技術一樣變溫擴增，只需在恒溫條件（60～65℃）下就可完成反應，并且結果可以目測判斷。現今LAMP技術在結核病的診斷應用方面也已有相關研究［3-9］并顯示出良好的臨床效能。2016年世界衛生組織推薦該技術用于有肺結核臨床癥狀和體征的成人［10］。

GeneXpert MTB/RIF檢測系統是一種以半巢式實時定量PCR為技術基礎的全自動結核分枝桿菌檢測系統，能同時檢測結核分枝桿菌及利福平耐藥并在2 h內完成，具有快速，準確，操作簡單等優點。世界衛生組織已批準GeneXpert MTB/RIF用于結核分枝桿菌及多重耐藥結核分枝桿菌的快速診斷。國內外也已有應用GeneXpert MTB/RIF檢測系統的臨床研究［11-13］。

本研究通過應用LAMP法對臨床確診為肺結核的患者和非結核患者進行結核分枝桿菌的檢測，并同時與痰涂片法進行對比分析，來評估其在肺結核尤其是涂陰肺結核中的診斷價值。傳統結核分枝桿菌PCR檢測技術作為一種快速檢測技術，需要PCR實驗室，考慮到現有基層結核診療機構的設施現狀，以及目前同樣作為快速診斷技術的GeneXpert MTB/RIF全自動檢測系統不需要如此嚴格的實驗場地及人員素質要求的優勢，本研究采用GeneXpert MTB/RIF全自動檢測系統，來對比分析LAMP技術，以此評估LAMP技術在涂陰肺結核快速診斷方面的臨床價值及優點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016～2017年本院臨床診斷為肺結核的患者170例，非結核患者100例，本次入選研究對象在16～61歲之間。

1.2 儀器與試劑 lamp法檢測試劑盒由廣州迪澳生物科技有限公司提供；GeneXpert MTB/RIF檢測試劑盒由美國Cepheid公司提供；儀器：恒溫擴增儀由廣州迪澳生物科技有限公司提供；Gene Xpert儀器由美國Cepheid公司提供。

1.3 質控菌株 結核分枝桿菌H37Rv來自深圳市慢性病防治中心，大腸埃希菌由本院提供。

1.4 方法 對入選的所有痰標本進行lamp法、痰涂片抗酸染色法以及GeneXpert MTB/RIF檢測。

1.4.1 LAMP技術 按照產品說明書操作。每批次樣本檢測的同時行陰陽性對照及質控。

1.4.1.1 樣本處理 將痰樣本中加入等體積的4%NaOH溶液，渦旋振蕩混勻，室溫靜置15 min，吸取1 mL加入離心管中，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 min，去上清，加入1 m L 0.9%NaCL混勻，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 min，去上清，加入100 μL DNA提取液混勻，100℃加熱10 min后迅速冷卻，12 000 r/min（離心半徑25 mm）離心2 min，取2 μL上清液用于核酸擴增。

1.4.1.2 加樣擴增 在含22 μL反應液及1 μL Bst聚合酶的PCR反應管中加入20 μL密封液并將2 μL模板加入密封液面以下，10 000 r/min（離心半徑25 mm）離心5 s，放入恒溫擴增儀中，63℃擴增45 min。

1.4.1.3 結果判定 擴增曲線呈“S”型曲線，判斷為陽性，含有結核分枝桿菌復合群；擴增曲線呈一條直線或傾斜直線，判斷為陰性，不含有結核分枝桿菌復合群或低于檢測限（1×102/mL）。

1.4.2 GeneXpert MTB/RIF 操作及判讀嚴格按說明書進行檢測。根據痰液標本的性狀，加入合適體積的標本處理液，一般為痰液體積的兩倍，搖動數次，并靜置10～15 min，待痰液全部溶解，吸取2 mL全部溶解的痰液至GeneXpert MTB/RIF反應試劑盒，注意不要產生氣泡，將反應盒放入Gene Xpert儀器檢測，不可將反應盒顛倒搖晃。

1.4.3 痰涂片抗酸染色法 按照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》操作。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計分析，對計量資料采用百分比和描述，方法間配對計數資料的比較采用McNemar檢驗和Kappa一致性檢驗。率的比較采用χ2檢驗。χ2檢驗及McNemar檢驗以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMP技術與痰涂片抗酸染色比較 在170例肺結核患者組中，LAMP法檢出83例陽性，陽性率為48.8%，痰涂片抗酸染色檢出60例陽性，陽性率35.2%。兩種方法一致性分析，兩者一致性一般（κ=0.680）。McNemar檢驗分析顯示，兩方法差異有統計學意義（P＜0.05）。在肺結核患者組LAMP法敏感性高于痰涂片抗酸染色法，陽性率約13%的差異。見表1。LAMP法恒溫擴增曲線圖見圖1。

圖1 LAMP法恒溫擴增曲線圖Fig.1 Graph of isothermal amplification curve using LAMP

表1 三種檢測方法的比較Tab.1 Comparison of three detection methods

2.2 LAMP法在涂陰肺結核、涂陽肺結核及非結核患者中的比較 根據痰涂片抗酸染色的結果，將肺結核患者組分為涂陰及涂陽肺結核兩組進行分析。LAMP法在肺結核組與非結核組的陽性檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=60.908，P＜0.05）。110例涂陰肺結核患者中，LAMP檢出陽性26例；60例涂陽肺結核患者中，LAMP檢出陽性57例；100例非結核患者中，LAMP檢出陽性3例。LAMP法在涂陰肺結核患者、涂陽肺結核患者及非結核患者中的陽性率分別為23.6%（26/110）、95.0%（57/60）、3.0%（3/100）。將涂陰肺結核與涂陽肺結核組的陽性檢出率比較，兩組的陽性檢出率差異有統計學意義（χ2=79.132，P＜0.05）。涂陰肺結核組與非結核組的陽性檢出率比較，兩組的陽性檢出率差異有統計學意義（χ2=18.741，P＜0.05）。涂陽肺結核組與非結核患者組的陽性檢出率比較，兩組的陽性檢出率差異有統計學意義（χ2=135.4，P＜0.05）。LAMP技術在涂陽肺結核患者組的陽性率最高。見表2。

2.3 GeneXpert MTB/RIF技術分析 GeneXpertMTB/RIF在肺結核患者組中檢出陽性89例，其陽性率為52.4%（89/170），其在肺結核組與非結核組的陽性檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=78.096，P＜ 0.05）。

表2 LAMP法和GeneXpert MTB/RIF檢測結果比較Tab.2 Comparison of LAMP and GeneXpert MTB/RIF Test Results

2.4 LAMP法與GeneXpert MTB/RIF技術比較兩方法在肺結核患者組的陽性率分別為48.8及52.4%，見表1。兩種方法一致性分析，兩者一致性最佳（κ=0.906）。McNemar檢驗分析顯示，兩方法陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。在110例涂陰肺結核患者組中，以Xpert MTB/RIF技術為標準，LAMP法的敏感度為82.8%（24/29）、特異度為97.5%（79/81），總體一致率93.6%（103/110）。兩種方法一致性分析，兩者一致性最佳（κ=0.879）。McNemar檢驗分析顯示，兩方法陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

目前由于多重耐藥結核的增加以及HIV合并感染的出現等一系列的原因，結核病已成為全球性的公共衛生難題，在我國結核病的就診人群以肺結核患者居多［1］。疑似肺結核的患者如若抗酸染色痰涂片檢測陰性，在基層診療機構中，臨床往往需要結合痰培養結果以及診斷性治療的情況等才能判斷是否為結核病，但作為金標準的羅氏培養法通常需要4～8周的時間，耗時長，敏感度較低，這無疑會增加人群感染的風險以及延誤患者的治療，因此簡單快速，高效價廉的結核檢測技術對于涂陰肺結核的診斷具有重要意義。

抗酸染色痰涂片法陽性檢出率受痰標本質量，取樣時間以及排菌量等的影響較大，靈敏度較低。LAMP技術通過高效DNA聚合酶識別目標基因，在恒溫狀態擴增45 min即可完成反應，全過程只需2 h完成，在時間和設備上充分滿足了臨床檢測需要，特別是對于基層診療機構而言，具有巨大優勢。本研究結果顯示LAMP法與痰涂片抗酸染色法相比，LAMP法在肺結核組中的陽性檢出率高，高出約13%。有研究［6］顯示，LAMP法在診斷結核病方面表現優于常規涂片鏡檢，這與本研究一致。LAMP法在涂陽肺結核患者組的陽性率為95.0%，與涂陰肺結核患者中的陽性檢出率為23.6%相比，LAMP法在涂陽肺結核患者組的敏感性更高。國外研究顯示，LAMP法在涂陽肺結核的陽性率為92.0%，在涂陰肺結核的檢測中，涂陰比涂陽的陽性率低，這與本研究結果相近［9］。LAMP法在涂陽涂陰肺結核患者組的陽性率差別，可能是由于患者痰標本中結核分枝桿菌的量不同造成。抗酸染色痰涂片法不能區分結核分枝桿菌及非結核分枝桿菌，調查顯示，非結核分枝桿菌感染在疑似結核的就診人群占有一定的比例［14］，應用LAMP法技術可以在2 h內區分出痰標本中是結核分枝桿菌還是非結核分枝桿菌，減少了醫療差錯的發生，這有利于臨床作出正確的診斷及制定治療方案。本次研究中痰涂片抗酸染色陽性而LAMP法檢測陰性的樣本有可能是由非結核分枝桿菌感染所致。對于臨床常規開展的結核病檢驗項目抗酸染色痰涂片法而言，其需要具有專業經驗的人員進行鏡檢，效率低，而LAMP法操作簡單，易于批量操作，便于準確而及時的出具檢驗結果。

GeneXpert MTB/RIF是近年來世界衛生組織批準推薦的結核分枝桿菌快速檢測技術，其不但可以快速檢測結核分枝桿菌而且可以檢測利福平耐藥，本研究將LAMP技術與GeneXpert MTB/RIF這一種近年來應用的結核分枝桿菌快速檢測技進行比較，以此評估LAMP技術的效能。有研究顯示GeneXpert MTB/RIF在涂陽結核患者中的診斷性高于涂陰結核患者，其在涂陰肺結核的診斷上也有很好的臨床價值［15-16］，這與本研究結果一致。LAMP技術和GeneXpert MTB/RIF技術檢測涂陰肺結核患者組的陽性檢出率分別為23.6%和26.4%，兩者的陽性檢出率差異無統計學意義，一致性分析最佳，這表明兩種方法在涂陰肺結核中的診斷效能一致。REDDY等［7］研究數據顯示LAMP技術比GeneXpert MTB/RIF的敏感性高，本研究結果顯示，LAMP技術在肺結核組的檢出率與GeneXpert MTB/RIF無差異，這可能是人群差異造成。有研究表明痰標本質量對GeneXpert MTB/RIF具有影響［17］，因此痰標本質量也可能引起上述結果。

LAMP技術優點與局限性：LAMP技術操作簡單、不需要系統專業的培訓、用時少、生物安全性高，與GeneXpert MTB/RIF相比檢測費用較低，設備環境要求較低，但其不能區分死菌和活菌，且不能像GeneXpert MTB/RIF一樣在檢測結核分枝桿菌的同時檢測耐藥，這在一定程度上影響了其臨床應用。

綜上所述，LAMP技術在涂陰肺結核痰標本快速檢測方面具有良好的診斷效能，具有較好的臨床應用價值和應用前景。