骨髓間充質干細胞治療對神經系統疾病免疫指標的影響及臨床療效

周小琳 李棟方 李平甘 羅向陽

中山大學孫逸仙紀念醫院小兒神經內分泌專科（廣州 510120）

目前許多神經系統疾病仍無有效治療方法，如脊髓炎、格林巴利綜合征、多發性硬化等，預后較差，致殘率高，家庭、社會負擔很重。近年來隨著干細胞研究越來越深入，干細胞的多種治療功能被人們發現和認識，干細胞治療成為治療神經系統疾病的熱點。骨髓間充質干細胞（bone mar?row mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓中的一種干細胞，研究發現MSCs具有調節免疫和保護神經的作用［1］。MSCs具有自我增殖和多向分化能力，易于體外培養和擴增，具有較低的免疫原性，國內外已有不少應用骨髓問充質干細胞治療神經損傷的研究。本實驗前期研究發現，多種神經系統疾病存在免疫功能紊亂，抑制神經系統免疫炎癥反應可能對疾病恢復有幫助［12］。本文就MSCs對神經系統疾病免疫功能的影響及臨床療效做初步探索。

1 對象與方法

1.1 研究對象 病例選自2014年11月至2017年11月我科住院部收治的患兒，共30例，其中脊髓炎10例，腦炎12例，格林巴利綜合征4例，多發性硬化4例，年齡1～15歲。納入標準：（1）患兒均有相應的臨床癥狀，并符合神經系統影像學、腦脊液等檢查的表征；（2）脊髓炎、腦炎、格林巴利綜合征、多發性硬化均符合第8版《諸福棠實用兒科學》中神經系統疾病的診斷標準；（3）入選前均經醫院醫學倫理委員會審核通過，所有患兒家屬均簽署了知情同意書。排除標準：合并其他系統嚴重并發癥，如心、肝、腎功能不全，或者嚴重過敏體質可能對MSCs過敏者。正常對照組為本院體檢健康兒童30例，近期均無感染史、無自身免疫性疾病史和其他疾病史，其中年齡和性別構成比例與病例組差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 研究方法

1.2.1 MSCs治療方法 所有病例組患兒均在傳統治療的基礎上，加用MSCs進行治療。MSCs 10× 106/次，靜脈注射，1次/周，共4次。所有MSCs均由本院生物治療中心采集、培養、凍存，所有標本在注射前均經過嚴格細胞學鑒定，除外感染、惡性病變等情況，符合使用標準。

1.2.2 免疫指標檢測 在治療前和治療結束后空腹抽靜脈血2 mL，在6 h內取抗凝全血40 μg，去除紅細胞，加入 CD19+、CD20+、CD4+、CD8+單克隆抗體，室溫下孵育20 min后上機檢測。淋巴細胞亞群采用FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）檢測。最后由CD4+、CD8+檢測值計算CD4+/CD8+比值。

1.2.3 臨床觀察指標 對比治療前后病例組患兒臨床癥狀、神經功能、頭顱MRI有無改善。

1.3 統計學方法 實驗數據處理采用SPSS 21.0軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床療效及頭顱MRI改變情況 病例組30例患兒MSCs治療結束后，24例臨床癥狀改善，6例臨床癥狀無明顯改善。病例組30例患兒均存在頭顱或脊髓MRI異常，治療后25例病灶有改善。

2.2 病例組與正常對照組外周血免疫指標表達水平比較 與正常對照組相比，治療前病例組患兒外周血CD19+、CD20+比例明顯升高（均P＜0.05）；CD4+、CD4+/CD8+比例降低，CD8+T細胞百分比升高（P＜0.05）。見表1。

表1 病例組與正常對照組外周血免疫指標表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

表1 病例組與正常對照組外周血免疫指標表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of immune indexesin peripheral blood between case group and normal control group ±s，%

組別病例組正常對照組t值P值例數30 30 CD19+34.66±10.80 16.15±3.51 8.92 0.00 CD20+33.90±11.38 15.95±3.43 8.09 0.00 CD4+23.51±6.59 33.21±5.80 6.05 0.00 CD8+26.61±6.40 22.27±5.98 2.71 0.01 CD4+/CD8+1.08±0.45 1.60±0.48 4.27 0.00

2.3 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達水平比較 病例組患兒經MSCs治療后，24例癥狀明顯改善，6例癥狀無明顯改善。癥狀改善組外周血CD19+、CD20+比例較治療前明顯降低（P＜0.05）；癥狀無改善組該指標與治療前相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達水平比較Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non?improved group ±s，%

表2 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD19+、CD20+表達水平比較Tab.2 Comparison of expression levels of CD19+and CD20+in the peripheral blood before and after treatment in theimprovement groupand the non?improved group ±s，%

注：a與b比較，c與d比較，P＜0.05；其余指標治療前后比較，均P＞0.05

CD19+CD20+組別癥狀改善組癥狀無改善組例數24 6治療前34.47±10.19a 36.82±15.10治療后17.80±5.15b 35.6±15.57治療前33.66±10.80c 35.68±15.83治療后17.20±4.96d 35.00±14.11

2.4 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達水平比較 癥狀改善組的24例患兒外周血CD4+、CD4+/CD8+比例較治療前明顯升高，CD8+比例較治療前明顯降低（P＜0.05）；癥狀無改善組患兒外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比例與治療前相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達水平比較Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non?improved group ±s，%

表3 癥狀改善組與癥狀無改善組治療前后外周血CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達水平比較Tab.3 Comparison of expression level of CD4+，CD8+and CD4+/CD8+in peripheral blood before and after treatment in the improvement groupand and non?improved group ±s，%

注：a與b相比，c與d相比，d與f相比，均P＜0.05；其余指標治療前后比較，均P＞0.05

組別癥狀改善組癥狀無改善組例數24 6 CD4+治療前23.33±6.95a 24.23±5.38治療后31.85±6.15b 23.25±5.06 CD8+治療前26.56±5.97c 26.80±3.74治療后21.34±5.41d 26.15±4.72 CD4+/CD8+治療前1.08±0.49e 1.10±0.27治療后1.63±0.66f 1.00±0.23

3 討論

中樞神經系統疾病的免疫改變錯綜復雜，在大腦發育過程中神經元和神經膠質細胞的產生受多種機制調節，免疫系統與大腦發育息息相關。T細胞、B細胞等免疫細胞從胚胎期開始就存在于大腦中，有報道中樞神經系統中的B細胞介導中風后的認知障礙，并可以通過分泌致病性抗體來防止脊髓損傷后的功能恢復［2］。B細胞在成人脫髓鞘疾病中也發揮有害作用，可以分泌針對髓鞘的自身抗體誘導脫髓鞘的發生［3］。T細胞具有介導大腦發育過程中神經元可塑性的能力，有報道顯示在炎癥致敏的缺氧缺血性新生兒腦損傷中，CD4+T細胞浸潤受損的大腦并刺激小膠質細胞激活，從而加劇神經炎癥反應［4］。有學者發現格林巴利綜合征、多發性硬化患者的腦脊液中發現B淋巴細胞和T淋巴細胞比例異常，治療后患者癥狀好轉，B淋巴細胞和T淋巴細胞比例趨于正常［5］。本研究也發現腦炎、脊髓炎等中樞神經系統疾病外周血CD19+B細胞和CD20+B細胞比例與健康對照組相比明顯升高，提示B淋巴細胞過度活化，體內免疫功能亢進；同時結果顯示中樞神經系統感染時，CD4+T細胞及CD4+/CD8+比例降低，CD8+T細胞百分比升高，說明中樞神經系統感染存在T淋巴細胞免疫功能紊亂，這與既往學者研究結果相一致。結合本研究結果及國內外研究，B淋巴細胞和T淋巴細胞功能紊亂可能在中樞神經系統發病過程中起著重要的作用。

很多中樞神經系統疾病經常引起不同程度的功能障礙，臨床上傳統治療很難治愈而且治療的效果有限，近年來干細胞治療神經系統疾病成為了熱點。既往國內外很多研究證明，MSCs治療神經系統疾病有效，MSCs可以促進損傷腦組織恢復，分泌神經營養因子并遷移至病灶處發揮神經保護作用［6-7］。在一項觀察自體骨髓間充質干細胞移植治療神經系統疾病的研究中發現，MSCs治療后患者神經系統明顯提高，隨時間推移臨床癥狀逐漸好轉，不良反應較少［8］。有學者發現MSCs治療多發性硬化患者臨床有效率高，并且用多發性硬化患者自體骨髓MSCs培養擴增后再回輸，可以達到同樣的臨床效果［9］。本實驗小組前期研究發現MSCs能抑制EAE大鼠動物模型炎癥反應，在臨床上應用MSCs治療多名多發性硬化患兒，在改善患兒運動功能、感覺障礙、延長疾病緩解期，減少復發等方面均取得了明顯的效果，說明MSCs發揮了良好的神經免疫保護作用。本研究結果也顯示MSCs治療后癥狀改善組患兒外周血B淋巴細胞和T淋巴細胞指標均明顯改善，而癥狀無明顯改善組患兒外周血免疫指標與治療前相比較無明顯改變，MSCs治療脊髓炎、腦炎、多發性硬化等神經炎癥性疾病取得良好的臨床療效。

MSCs治療神經系統疾病療效確切，但其具體的治療機制尚未完全清楚，有以下幾種可能：（1）MSCs可以分化成為神經元樣細胞，能夠經血管內給藥后遷移到損傷部位，并且可通過血腦屏障進入中樞神經系統發揮重要作用［10］；（2）MSCs可分泌出一系列強有力的旁分泌作用因子，通過提供營養支持、抑制炎癥和調節免疫細胞功能來促進組織修復［11-12］，我們前期研究也發現MSCs在體外細胞實驗中能抑制BV2小膠質細胞的炎癥反應，發揮抗炎作用［13］；（3）如本結果研究所示，MSCs通過抑制外周血T、B淋巴細胞免疫功能發揮神經保護作用，比如分泌某些可溶性因子直接抑制B細胞增殖和趨化潛能［14］。

綜上所述，外周血T、B淋巴細胞過度活化可能促進中樞神經系統疾病的病情發展。MSCs輸注作為有效的免疫調節及神經保護的治療手段，其低免疫原性提高了同種異體移植的可能性，同種異體MSCs移植均不引起淋巴組織增殖反應［15］，且培養簡單，臨床應用方便，在治療神經系統疾病領域中有著良好的前景。