多囊卵巢綜合征卵泡液代謝輪廓分析及對IVF?ET妊娠結局的影響

曾偉宏 李子濤 陳創奇 梁嘉穎 歐陽海梅 梁金群 謝汛杰 陳暖 江劍輝

廣東省婦幼保健院（廣州 511442）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS），尤其是難治性PCOS患者，在進行IVF?ET時高雄激素易發生卵巢過度刺激綜合征，存在卵細胞質量下降，受精率降低等難點問題。近年來隨著代謝組學的興起，逐漸成為生命科學研究熱點，并有效應用于IVF?ET中，尤其是卵泡液代謝組學的研究越來越受到重視。研究表明卵泡液相關代謝物如糖類、激素等可預測卵母細胞發育潛能，而PCOS患者內分泌疾病機體內環境改變直接或間接影響卵泡液微環境，使其物質組成和代謝水平變得更復雜更多樣性。因此，本研究通過質譜代謝組學分析，對PCOS和對照組的卵泡液進行全面的氨基酸、脂肪酸、有機酸代謝物定性和定量分析，尋找差異性代謝產物，進一步完善PCOS卵泡液代謝譜，為改善卵母細細質量、優化卵子培養液提供可靠依據，為探討胚胎發育潛能和提高妊娠率提供早期、無創、準確可靠的方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選自2016年7月至2017年8月期間廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥中心確診的PCOS患者80例，年齡22～42歲，平均（28.5±4.5）歲。因輸卵管因素或男方因素致女性不孕者為正常對照組85例，年齡24～39歲，平均（29.0±5.3）歲。多囊卵巢綜合征入選標準及排除標準參照2003年歐洲人類生殖和胚胎學會與美國生殖醫學學會頒布的鹿特丹標準［1］：（1）稀發排卵或無排卵；（2）高雄激素血癥或高雄激素的臨床表現（如多毛、痤瘡等）；（3）超聲表現為卵巢多囊樣改變：一側或雙側卵巢直徑2～9 mm的卵泡數≥12個，或（和）卵巢體積≥10 mL。符合上述3條中的2條，同時排除：（1）高雄激素血癥的其他原因；（2）高泌乳素血癥；（3）甲狀腺疾病；（4）先天性腎上腺皮質增生癥；（5）庫欣綜合征；（6）分泌雄激素的腫瘤等。對照組納入標準：（1）月經規律；（2）基礎激素水平正常，雙側竇狀卵泡＞5個；（3）近6個月未使用任何甾體激素類藥物；（4）同時排除：染色體異常，患有精神疾病及性傳播疾病，子宮內膜病變、子宮內膜異位癥、子宮畸形；卵巢囊腫等。本研究獲得患者書面同意，并經醫院倫理委員會批準［第201601067號］。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集和送檢 （1）血液標本：所有患者在月經周期第3天采取靜脈血2～5 mL，然后1 610×g離心15 min分離血清，立即上機檢測。（2）卵泡液標本：采用低劑量促性腺激素促排卵方案，采用B超引導下經陰道取卵，選擇直徑為12～18 mm的卵泡穿刺取卵，留取第一管無明顯血染的卵泡液，后立即以1 610×g離心10 min，取上清液分裝于2個2 mL Eppendorf管中，標記后立即檢測（如無法立即檢測可置于-80℃冰箱保存待測）。

1.2.2 儀器和試劑 美國AB公司API3200串聯質譜儀，日本島津GC?MS?QP2010 ultra氣相色譜質譜儀，雅培I2000化學發光儀，ELX800免疫酶聯免疫分析儀，艾本德5804R高速冷凍離心機，美國Tal?boys多管漩渦混合器，博迅GZX?9070MBE電熱干燥箱，天津奧特賽恩MTN?2800W氮吹濃縮裝置。試劑：美國perkinelmer公司串聯質譜氨基酸與酰基肉堿非衍生化試劑及配套質控品，氣相色譜質譜有機酸、脂肪酸標準品和流動相甲醇均采用美國SIGMA公司，氫氧化鈉和濃鹽酸采用廣州化學試劑廠，性激素選用羅氏配套試劑，廣州康潤生物抗苗勒管激素（anti?Mullerian hormone，AMH）定量試劑。

1.2.3 血清基礎激素和卵泡液代謝物檢測

1.2.3.1 基礎激素檢測 通過化學發光法檢測血清卵泡刺激素（follicle?stimjlating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、孕酮（preg?nendione，PROG）、雌二醇（estradiol，E2）、泌乳素（prolactin，PRL）、睪酮（testosterone，T）；用熒光酶聯免疫法檢測AMH激素水平。

1.2.3.2 卵泡液氨基酸檢測 取卵泡液10 μL置入V型微孔板內，每孔添加100 μL工作液（甲醇：氨酸酸內標液為1∶108，用黏性封膜密封微孔板，確保密封良好，密封后，立即將微孔板置于孵育振蕩器內，45℃，650～750 r/min振蕩45 min，每孔轉移75 μL萃取液到另一V型微孔板進入液相串聯質譜分析系統檢測。實驗方法條件：（1）流動相由甲醇和水以80/20（v/v）的比例組成；（2）流速為1 mL/min；（3）電噴霧器溫度400 ℃；（4）錐孔氣流量50 L/h；（5）質譜掃描范圍：100～600 m/z。

1.2.3.3 脂肪酸檢測 吸取100 μL卵泡液，冰水中冷卻下慢慢加入0.5 mL乙酰氯，沸水浴加熱1 h，然后加入5 mL 6%Na2CO3中和，加入2 mL苯，2 000×g離心5 min，吸取苯層，重復提取1次并合并苯提取液，用氮氣吹干，加入100 μL正己烷溶解樣品，采用氣相色譜質檢分析系統檢測GC?MS分析棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞麻酸、亞油酸脂肪酸及花生四烯酸。實驗方法條件：（1）色譜柱：Rtx?5ms（30 m× 0.25 mm × 1.0 μm）；（2）柱溫：150 ℃保留1 min，以10℃/min速率上升到230℃保留11 min，然后以10℃/min速率降至250℃保留3 min，30℃/min升至300℃保留2.5 min，30℃/min升至320℃保留3 min；（3）進樣口溫度：250 ℃；（4）線速度36.8 mL/min；（5）進樣方式：分流（10∶1）；（6）色譜質譜接口溫度：280 ℃；（7）質譜掃描范圍：50～350 m/z。

1.2.3.4 有機酸檢測 取1 mL卵泡液，依次鹽酸羥胺肟化酮酸、乙酸乙酯萃取、N?O?雙（三甲硅基）三氟乙酰胺衍生化有機酸等步驟后采用GC?MS進行分析［2］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計和分析，正態分布數據通過均值和標準差表示，區組使用獨立樣本t檢驗；非正態分布數據，均以中位數（M）和四分位數間距（Q）表示，區組差異使用秩和檢驗，區組陽性率比較使用卡方檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內分泌基礎激素情況 PCOS患者年齡、身體質量指數（BMI）、血清FSH、E2、PRL與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），而LH、PROG、T及AMW明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 患者血清基礎激素濃度水平Tab.1 Basal hormone levels of serum in patients x±s

2.2 PCOS組與對照組體外受精結局比較 PCOS組獲卵數、正常受精率、臨床妊娠率顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），而胚胎著床率兩組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 PCOS組和對照組體外受精結局情況Tab.2 In vitro fertilization outcome of PCOS group and control group

2.3 卵泡液氨基酸、脂肪酸、有機酸代謝色譜質譜檢測 通過保留時間和特征離子進行物質定性檢測，樣本根據內標法結合標準品濃度進行定量，比較樣本與標準品離子響應強度、峰高或峰面積計算樣本濃度，代謝物色譜質譜圖。PCOS組4種氨基酸：丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸及脯氨酸離子豐度低于對照組，而精氨酸高于對照組；PCOS組6種有機酸：乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸及3-羥基異丁酸離子豐度高于對照組（圖1）；PCOS組6種脂肪酸：棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸濃度峰面積高于對照組。見圖2。

圖1 對照組和PCOS組有機酸總離子流圖Fig.1 Organic acids total ion chromatography of control group and PCOS group

圖2 對照組和PCOS組脂肪酸色譜圖Fig.2 Fatty acids chromatography of control group and PCOS group

2.4 PCOS組與對照組卵泡液差異代謝物分析 通過檢測11種氨基酸、6種脂肪酸及135種有機酸，發現PCOS組卵泡液丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、脯氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羥基異丁酸高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），而PCOS組精氨酸低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

卵泡液是卵母細胞賴以生存的微環境，是卵母細胞與周圍細胞進行物質交換和能量代謝的場所，其代謝物組成氨基酸、脂肪酸、有機酸等對卵母細胞的成熟發揮著重要作用［3］，并且能間接反映卵母細胞代謝水平［4］。本研究通過分析卵泡液氨基酸、脂肪酸、有機酸代謝譜，同時測定患者血清性激素和AMH濃度水平，結果顯示PCOS組血清LH、T、PROG、AMH明顯高于對照組，過高的T易導致高E2血癥從而增加卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發生率，AMANO等［5］報道卵泡液中過低的酪氨酸濃度也易發生OHSS，而沈亞等［6］報道成熟卵泡越多，卵子質量越好，血E2將越高。本研究PCOS組血E2及卵泡液酪氨酸與對照組無明顯差異，一方面反映PCOS組卵巢并未受到過度刺激，另一方面提示兩組中的E2不能單獨反映卵泡質量及胚胎質量。過高LH可使卵細胞質量下降，可能導致PCOS組比對照組受精率更低，從而影響妊娠。PCOS患者卵泡發育異常與高AMH有關，過高的AMH可抑制PROG的分泌，而PCOS組血PROG水平并沒有低于對照組，可能是AMH要達到一定濃度才能抑制顆粒細胞分泌PROG，這間接說明PCOS患者血雄激素和LH與AMH協同作用更強。國外有報道［7］，通過分析PCOS患者血清和卵泡液AMH關系，血清AMH是預測卵巢過度刺激綜合征風險率的良好指標。

表3 患者卵泡液代謝物分析（中位數，四分位數間距）Tab.3 Analysis of the metabolites of follicular fluid in patients（M，Q） μmol/L

本研究通過比較正常對照組和PCOS組代謝譜，發現PCOS組5種氨基酸、6種有機酸及6種脂肪酸與對照組差異具有統計學意義。其中PCOS組卵泡液精氨酸明顯增高，而精氨酸與獲卵數及獲胚數呈負相關［8］，這可能是導致妊娠結局獲卵數PCOS組少于正常對照組的原因。有報道谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸濃度與囊胚形成呈正相關［9］，N-乙酰半胱氨酸可改善卵母細胞和胚胎質量［10］，本研究PCOS患者卵泡液除丙氨酸、甘氨酸外，瓜氨酸及脯氨酸也低于正常對照組，卵泡液氨基酸一種或多種的改變提示可影響卵母細胞發育潛能，可能對妊娠結局產生積極影響。脂肪酸是卵母細胞提供能源的主要物質，NIU等［11］報道PCOS患者卵泡液與血清中主要卵泡液油酸、棕櫚酸、硬脂酸、十一烷酸以及亞油酸水平顯著升高，與本研究PCOS組中油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸以及花生四烯酸均高于對照組相符。有報道［12］受精并卵裂與受精未卵裂患者卵泡液脂肪酸，后者飽和脂肪酸升高、不飽和脂肪酸降低，而且胚胎碎片得分與其卵泡液中油酸含量呈正相關。過高的脂肪酸有可能影響卵泡液葡萄糖的利用及其轉運［13］，從而對卵母細胞發育潛能及妊娠結局產生重要影響。有機酸是氨基酸、脂肪、糖代謝過程中所產生的羧基酸，卵泡液有機酸增高是某種酶缺乏造成代謝障礙原因之一。目前，國內外對卵泡液有機酸研究報道甚少，上海交通大學夏蘭在反復IVF失敗患者卵泡液分析中［14］，發現氨基己二酸、6-硝基-2-氨基己酸、氨基丙酮酸、3-羥丁酸、戊二酸、甲基-2-酮基丁酸高于1次行IVF?ET成功妊娠者，且代謝機制未明。本實驗結果顯示PCOS組乳酸、2-酮異戊酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸、3-羥基異丁酸高于對照組。高乳酸可能與卵母細胞在利用葡萄糖、脂肪酸等能量物質過程中發生代謝障礙造成丙酮酸增高，進而產生大量的乳酸，過多的乳酸和二羧基酸（2-酮異戊酸酸，戊二酸，3-羥基異丁酸）會給卵母細胞發育及成熟造成不利影響。

綜上所述，卵泡液代謝輪廓分析能較客觀、全面、準確、無創地反映胚胎的發育潛能，可作為胚胎形態學評估的補充，但卵泡液成分復雜，任何改變微環境的物質或因子都可能影響妊娠結局，除上述氨基酸、脂肪酸、有機酸可影響妊娠結局之外，同時還與患者的激素水平、肥胖和胰島素抵抗［15］等因素有關，因此應從多方面、多因素進行綜合分析評估，不斷優化實驗方案，提高胚胎妊娠率。