外源性膽汁酸恢復膽道外引流導致的肝再生障礙及其機制

謝經豐 范基元 袁晟光

桂林醫學院附屬醫院肝膽胰外科（廣西桂林 541001）

臨床上各種原因引起的梗阻性黃疸比較常見，如肝門部膽管癌（hilar cholangiocarcinoma，HC）、肝內膽管結石等，由于肝臟儲備功能較差，常常對此類患者進行肝部分切除術（partial hepatectomy，PH）前的膽道引流［1］。無論是術前膽道引流（per?cutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD）內外聯合引流術還是單純外引流術，術后血清總膽紅素均下降迅速。能有效地解除梗阻性黃疸［2］。但是，研究發現外引流后會導致肝切除術后肝再生缺陷，術后肝衰風險加大，肝臟恢復能力較未引流組差［3］。外引流導致肝部分切除術后肝再生障礙的機制普遍被歸于外引流打破了膽汁酸的腸肝循環繼而影響術后肝再生。外引流術在臨床被普遍采用而術后肝再生障礙又不可避免。但是外引流導致術后肝再生障礙機制尚不清楚［3］。HUANG等［4］證明膽道外引流同時補充0.2%外源性的CA飲食組較未補充外源性CA組能加速肝再生。但是，補充外源性膽汁酸可以恢復膽道外引流導致的肝再生障礙的具體機制尚不完全清楚。

研究發現膽汁酸與其受體法尼酯X受體（farnesoid X receptor，FXR）結合傳遞信號，在肝臟的損傷、修復中起重要作用。膽汁酸-FXR信號通路是正常肝再生所必需，通過膽汁酸的腸肝循環調節膽汁酸池的大小，將膽汁酸池維持在一個恒定的量［4］。肝臟表達的FXR和腸道FXR在肝損傷后的肝再生中都起作用，然而肝臟和腸道的FXR在肝再生過程所起的作用及相關作用機制是不一樣的。肝臟通過誘導轉錄因子（Forkhead box M1b，Foxm1b）的表達，而腸粘膜通過誘導FGF15（人類是FGF19）的表達調控肝再生［5］。那么外引流后腸道FGF15的表達情況會發生怎樣變化，補充外源性膽汁酸會不會恢復腸道FGF15的表達值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康雄性SD大鼠90只，體重約250 g左右，由湖南斯萊克景達SPF級實驗動物中心提供；膽汁酸購自Sigma公司（編號1001700885）；大鼠Ki?67抗體購自Abcam公司（編號ab1677767）；總RNA提取試劑盒（Tiangen公司，DP419）；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（Tiangen公司，KR103）；FGF15抗體購自LifeSpan BioSciences公司（產品編號LS?B15011?100）。

1.2 動物分組及處理 將90只雄性健康SD大鼠隨機分為3組：未引流組（n=30）、外引流（ED組，n=30）、外引流同時補充外源性0.2%CA組（ED+0.2%CA組）。

未引流組：開腹分離小段膽總管，不引流，實驗第7天行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

ED組：開腹分離小段膽總管，剪開小口，插入引流管，固定引流管，引流管另一端從腹腔引出行走皮下，在大鼠頸部引出固定，可以有效防止大鼠撕咬引流管，引流7 d后，行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

ED+0.2%CA組：ED模型建成后，每天給予一次3 mL 0.2%外源性CA，灌胃7 d后，行肝左葉、肝中葉約70%肝臟切除。

1.3 指標檢測

1.3.1 大鼠肝組織Ki?67表達檢測 免疫組化S?P法檢測Ki?67表達。高倍視野下選取10個視野，計數1 000個肝細胞中Ki?67陽性細胞（細胞核染成棕黃色為陽性）所占的百分比。

1.3.2 大鼠回腸組織FGF15 mRNA表達檢測 回腸組織經液氮研磨后，提取肝臟總RNA，隨后進行逆轉錄，逆轉錄產物進行PCR擴增。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環，最后72℃5 min延伸；GAPDH的反應條件為：94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃40 s，共25個循環，最后72℃5 min延伸。所得產物經過瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下拍照，Image J分析軟件測定目的條帶的灰度值，目的條帶與內參條帶灰度值的比值即為相對表達量。實驗重復3次。實驗所需引物均由上海生工生物技術公司合成。大鼠FGF15上游引物：5′?GTGTCGGATGA?AGGTCCACT?3，下游引物：5′?AGTCCACAGAGCC?GTCACTC?3′；GAPDH上游引物：5′?GAGGGAAAT?CGTGCGTGAC?3′，下游引物：5′?CTGGAAGGTGGA?CAGTGAG?3′。

1.3.3 大鼠回腸組織FGF15蛋白檢測 組織細胞裂解液中加入100∶1的PMSF提取回腸蛋白，參照試劑說明書，采用BCA法進行蛋白定量，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離，然后轉膜、封閉，加入一抗4℃過夜，TBST緩沖液洗滌后加入二抗，室溫搖床孵育1 h。暗室顯影定影后掃描記錄，Image J分析軟件測定目的條帶的灰度值。目的條帶與內參條帶灰度值的比值即為相對表達量。實驗重復3次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件分析，計量資料用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟 Ki?67陽性表達率 肝部分切除術后，ED組與ED+0.2%CA組和未引流組相比，Ki?67表達水平在48 h和72 h明顯降低（P＜0.05），ED+0.2%CA組與未引流組相比，Ki?67水平在48 h明顯降低（P＜0.05），其差異具有統計學意義。其他時間點（P＞0.05），差異不具有統計學意義（表1、圖1）。

2.2 回腸FGF15 mRNA及蛋白水平情況 ED組FGF15 mRNA及蛋白在肝部分切除術后時各時段表達水平較弱，明顯低于ED+0.2%CA組和未引流組（P＜0.05），FGF15 mRNA及蛋白表達呈現先上升后下降的總體趨勢，并在24 h達到高峰，峰值較ED+0.2%CA組和未引流組明顯偏低（P＜0.05）。而ED+0.2%CA組的FGF15蛋白及mRNA各時段的表達明顯低于未引流組，峰值較未引流組明顯偏低（P＜0.05）（表2、3，圖2、3）。

表1 各組各時間點肝切除術后Ki?67表達情況Tab.1 Positive expression rate of Ki?67 at different time points in each group（n=5）±s，%

表1 各組各時間點肝切除術后Ki?67表達情況Tab.1 Positive expression rate of Ki?67 at different time points in each group（n=5）±s，%

注:*與ED+0.2%CA組同時段比較，P＜0.05；#與未引流組同時段比較，P＜0.05

組別ED組ED+0.2%CA組未引流組25.62±1.79 24.12±2.85 23.35±2.43 55.39±9.32 48.67±5.64 58.25±8.56 62.16±6.65*78.76±7.43#91.43±8.65 42.65±7.21*56.87±6.43 78.56±7.37 0 h 24 h 48 h 72 h

圖1 各組肝切除術后肝臟組織Ki?67表達情況（免疫組化×400）Fig.1 The expression of Ki?67 of liver tissue after hepatectomy（Immunohistochemistry ×400）

表2 各組各時間點回腸FGF15 mRNA相對表達量（n=5）Tab.2 Relative expression levels of FGF15 mRNA at different time points in ileum tissue of each group ±s，%

注：*與ED+0.2%CA組比較，P＜0.05；#與未引流組比較，P＜0.05

組別ED組ED+0.2%CA組未引流組0 h 0.30±0.15*0.37±0.17#1.06±0.13 4 h 0.33±0.21*0.40±0.18#1.19±0.23 12 h 0.39±0.25*0.73±0.26#1.21±0.24 24 h 0.56±0.26*1.02±0.28#1.65±0.29 48 h 0.50±0.19*0.85±0.18#1.27±0.25 72 h 0.33±0.21*0.78±0.10#1.32±0.15

圖2 各組大鼠肝部分切除術后各時間點回腸組織FGF15 mRNA的相對表達Fig.2 The relative quantitative expression of FGF15 mRNA in ileum after hepatectomy

圖3 各組大鼠肝部分切除后各時間點回腸組織FGF15蛋白的相對表達Fig.3 The relative quantitative expression of FGF15 protein in ileum after hepatectomy

3 討論

擴大范圍手術切除是肝門部膽管癌患者獲得長期生存的唯一有效手段，這些患者術前往往合并有梗阻性黃疸增加了手術風險［6］。術前膽道引流減黃可以改善患者肝功能提高手術耐受力降低手術風險而被廣泛采用［7］。研究表明，膽道外引流對肝部分切除術后肝再生有明顯抑制作用，術后肝衰風險加大，病死率增高［8］。膽道外引流導致肝再生障礙機制尚不完全明了，如何克服膽道外引流導致的肝部分切除術后肝再生障礙是該領域尚未解決的關鍵問題，因而本實驗的創新之處在于模擬肝門部膽管癌手術過程，建立大鼠膽道外引流后肝部分切除動物模型，闡述膽道外引流導致肝再生障礙的可能機制，同時觀測動物模型灌胃補充生理濃度外源性膽汁酸能糾正術后肝再生障礙，闡述膽汁酸信號通路在膽道外引流導致肝再生障礙及肝細胞增殖的作用重要性，為臨床外引流策略法提供理論依據。

FGF15是FGFs家族的一員，高表達在小腸，主要是回腸，在肝臟不表達。膽汁酸通過激活大鼠腸道FXR促進肝再生，腸道FXR激活FGF15，FGF15通過門靜脈循環到肝臟，抑制膽汁酸合成［9］。在小鼠模型中，研究人員發現肝部分切除后FGF15缺失的小鼠肝損傷和死亡的風險更高，并伴有肝臟膽汁酸的升高［10-11］。FGF15基因敲除鼠表現肝臟再生延遲［12］。外源性的加入FGF15可以恢復腸道特異性FXR缺失和機體FXR敲除小鼠的肝損傷缺陷。腸道FXR和它誘導分子FGF15在肝臟保護過程中有重要的作用［13］。

膽汁酸在肝臟的合成受肝臟、腸道FXR的負反饋調節，被膽汁酸激活的肝臟FXR誘導小分子異源二聚體伴侶（short heterodimer partner，SHP）的表達，SHP抑制CYP7A1的表達［14］。在小鼠模型中，缺乏SHP會增加CYP7A1的表達［15-16］。回腸分泌的FGF15通過門靜脈到達肝臟與其受體FGFR4結合，后者通過激活下游分子的磷酸化來抑制膽汁酸合成的限速酶CYP7A1，CYP7A1的低表達可以防止殘肝膽汁酸負荷過高，從而對肝再生有益［17-18］。本研究結果顯示：肝切除術后，ED組FGF15蛋白和mRNA在肝部分切除術后時各時段表達水平較弱，明顯低于ED+0.2%CA組和未引流組（P＜0.05），FGF15蛋白及mRNA表達呈現先上升后下降的總體趨勢，并在24 h達到高峰，峰值較ED+0.2%CA組和未引流組明顯偏低（P＜0.05）。ED+0.2%CA組FGF15蛋白及mRNA各時段表達明顯低于未引流組，肝部分切除術后FGF15 mRNA及蛋白表達呈現先上升后下降的總體趨勢，并在24 h達到高峰，峰值較未引流組明顯偏低（P＜0.05）肝切除術后，ED組與ED+0.2%CA組和未引流組相比，肝組織增殖細胞核抗原（Ki?67）表達水平在48、72 h時間點明顯降低，ED+0.2%CA組與未引流組相比，肝組織增殖細胞核抗原（Ki?67）水平在48 h時間點明顯降低，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。其原因可能是ED組阻斷了膽汁酸的腸肝循環，導致FXR表達下調，進一步影響了腸道FGF15的表達，SHP表達下調，導致CYP7A1活性增強，肝內膽汁酸池含量增加，損害肝功能，進而延遲肝再生。當以外源性0.2%CA灌胃后，恢復了部分膽汁酸的刺激，使得腸道FGF15的表達增高，SHP表達上調，一定程度上抑制CYP7A1的活性，減輕了肝臟的膽汁酸負荷，在一定程度上促進了肝再生。

本研究結果證實，外源性膽汁酸可以恢復外引流引起的肝再生障礙，這種作用可能是通過激活腸道FGF15受體實現的。