熱量限制治療海綿體神經(jīng)損傷大鼠勃起功能障礙

盛明雄 萬(wàn)玲玲 劉昌明 李惠長(zhǎng) 張家彬

福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院泌尿外科（福建福安 355000）

熱量限制（caloric restriction）是指在保證生物體不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的情況下，限制每日攝取的總熱量；是延長(zhǎng)生物壽命的最可靠方法［1］，而且有抗腫瘤［2］和神經(jīng)保護(hù)［3］等多種作用。近年來(lái)熱量限制治療勃起功能障礙越來(lái)越引起關(guān)注，但其機(jī)制尚不明確。研究表明［4-5］熱量限制通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)硫作用引起內(nèi)源性硫化氫增多是其多種有益作用的主要機(jī)制。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是第3種被發(fā)現(xiàn)的具有內(nèi)源性活性的氣體信號(hào)分子［6］，在體內(nèi)具有重要的生理調(diào)節(jié)功能，包括促進(jìn)陰莖勃起［7］和神經(jīng)保護(hù)［8］等。本研究通過(guò)建立大鼠海綿體神經(jīng)損傷模型，分為假手術(shù)組、損傷對(duì)照組、H2S組和熱量限制組，觀察比較各組的血清H2S水平、勃起功能和海綿體神經(jīng)修復(fù)情況，旨在證實(shí)熱量限制能引起大鼠內(nèi)源性H2S升高，促進(jìn)損傷的海綿體血管神經(jīng)修復(fù)，從而治療海綿體神經(jīng)損傷大鼠的勃起障礙。

1 材料與方法

1.1 主要材料 硫化氫鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），H2S檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），甲苯胺藍(lán)（SIG?MA，批號(hào)：MKBF7921）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將112只SD大鼠（購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量為200～240 g，3個(gè)月齡，性交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)有正常性功能）隨機(jī)分為4組，每組28只：假手術(shù)組僅游離海綿體神經(jīng)3 mm并避免損傷；損傷對(duì)照組僅建立海綿體神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型；H2S組造模前1 h予NaHS（20 pmol/kg）腹腔注射，其他各組腹腔注射同量的生理鹽水；熱量限制組造模后按實(shí)驗(yàn)方案給予熱量限制。

1.2.2 海綿體神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型的建立 大鼠用1%的戊巴比妥50 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。備皮消毒后，取下腹部正中切口約2 cm逐層打開(kāi)至盆腔，延長(zhǎng)切口至陰莖根部，顯微鏡下在前列腺后外側(cè)找到并仔細(xì)游離雙側(cè)海綿體神經(jīng)（cavernous nerve，CN）3 mm，并用顯微血管鉗鉗夾CN 2 min，血管鉗扣合至最后一個(gè)咬齒，術(shù)中避免將海綿體神經(jīng)完全離斷導(dǎo)致造模失敗。術(shù)中注意無(wú)菌操作，術(shù)后予青霉素3萬(wàn)U腹腔注射以預(yù)防大鼠感染死亡。

1.2.3 熱量限制方案 除熱量限制組外的大鼠給予基礎(chǔ)飼料，自由攝食；熱量限制組給予基礎(chǔ)飼料并單籠喂養(yǎng)，第1周喂食量其他組平均攝食量的80%，第2周喂食量為其他組平均攝食量的70%，第3周后喂食量維持在其他組平均攝食量的60%直至處死。

1.2.4 血清硫化氫水平測(cè)定 分別于術(shù)后1、2、4、12周每組各隨機(jī)取7只大鼠，經(jīng)心臟采血提取血清測(cè)定大鼠血清硫化氫水平，采血后采用頸椎脫臼法處死。首先在離心管中加入0.25 mL血清、0.45 mL水和0.25 mL 1%醋酸鋅后室溫震蕩混勻；再加入0.25 mL10%三氯乙酸，14 000 r/min離心10 min；收集上清加入133 μL 20 mmol/L對(duì)氨基二甲苯胺鹽酸鹽，133 μL 30 mmol/L三氯化鐵，充分混勻，室溫孵育20 min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)665 nm檢測(cè)吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清H2S濃度。

1.2.5 陰莖勃起功能測(cè)定 術(shù)后12周各組7只大鼠均通過(guò)電刺激CN促使海綿體充血勃起，然后進(jìn)行陰莖海綿體內(nèi)壓（intracavernous pressure，ICP）及平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP）測(cè)定。

1.2.6 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色 術(shù)后1、2、4、12周取鉗夾處遠(yuǎn)端3 mm的海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，在顯微鏡下觀察CN整個(gè)橫切面軸突的數(shù)目。

1.2.7 免疫組化法檢測(cè)大鼠陰莖組織中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達(dá) 冰凍切片拿出后晾干，PBS洗3×3 min；3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×3 min；置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中熱修復(fù)，90℃修復(fù)15 min后自然冷卻至室溫，PBS沖洗3×3 min；滴加一抗4℃冰箱孵育過(guò)夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照），轉(zhuǎn)至室溫平衡30 min，PBS沖洗3×5 min；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗3×5 min；DAB反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素復(fù)染，脫水透明后封片。顯微鏡下觀察，每張免切片隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野（×200）觀察，進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，最終評(píng)分為兩者加和。染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0～5%分評(píng)為0分，6%～25%評(píng)1分，26%～50%評(píng)2分，51%～75%評(píng)3分，＞75%均評(píng)為4分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件分析。計(jì)量資料采用ANONA單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 所有大鼠飼養(yǎng)順利，成功建立海綿體神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型，術(shù)后恢復(fù)順利，無(wú)死亡。

2.2 各組大鼠血清H2S含量比較 術(shù)后1、2、4、12周，血清H2S熱量限制組和H2S組高于假手術(shù)組，而損傷對(duì)照組低于假手術(shù)組，熱量限制組和H2S組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較為穩(wěn)定，損傷對(duì)照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見(jiàn)表1。

2.3 陰莖勃起功能測(cè)定 配對(duì)t檢驗(yàn)顯示，損傷對(duì)照組大鼠在電刺激海綿體神經(jīng)時(shí)均無(wú)明顯陰莖勃起反應(yīng)，而假手術(shù)組、熱量限制組和H2S組大鼠在電刺激時(shí)有明顯陰莖勃起反應(yīng)。ANONA分析顯示電刺激前ICP/MAP比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電刺激后各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較LSD檢驗(yàn)顯示，熱量限制（P=0.000）和H2S組（P=0.000）低于假手術(shù)組，高于損傷對(duì)照組；而熱量限制組和H2S組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.051）。見(jiàn)表2。

表1 各組血清H2S含量比較（n=7）Tab.1 The comparison of serumal H2S between each group x± s，μmol/L

2.4 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色軸突數(shù) 術(shù)后1、2、4、12周，假手術(shù)組軸突數(shù)多于其他組，熱量限制組和H2S組多于損傷對(duì)照組，熱量限制組和H2S組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較為穩(wěn)定，損傷對(duì)照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見(jiàn)表3、圖1。

表2 術(shù)后12周各組ICP/MAP比值（n=7）Tab.2 The ratio of ICP/MAP 12 weeks postoperatively x±s

表3 術(shù)后各組海綿體神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)比較（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，條

表3 術(shù)后各組海綿體神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)比較（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，條

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與損傷對(duì)照組比較，bP＜0.05；與熱量限制組比較，cP＜0.05

組別假手術(shù)組損傷對(duì)照組熱量限制組H2S組F值P值1周85.6±1.27 56.4±1.13a 59.0±1.15ab 58.4±0.98ab 1 035.303 0.000 2周82.3±2.22 51.6±1.99a 62.4±1.72ab 61.4±0.98ab 369.740 0.000 4周84.0±2.45 37.4±2.07a 68.1±0.69ab 69.9±1.35ab 857.182 0.000 12周84.4±3.64 28.1±1.77a 78.4±0.98ab 78.7±1.50ab 989.864 0.000

圖1 海綿體神經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色（×200）Fig.1 The expression of cavernous myelinated axons by toluidine blue stain（× 200）

2.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠陰莖組織中NOS表達(dá)術(shù)后1、2、4、12周，假手術(shù)組NOS表達(dá)均多于其他組，熱量限制組和H2S組多于損傷對(duì)照組，熱量限制組和H2S組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；假手術(shù)組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較為穩(wěn)定，損傷對(duì)照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見(jiàn)表4、圖2。

3 討論

熱量限制是一種有計(jì)劃地減少由食物提供熱量的進(jìn)食方式，是指在保證生物體不發(fā)生營(yíng)養(yǎng)不良的情況下，將其正常進(jìn)食所得熱量減少30%～50%。熱量限制對(duì)機(jī)體有多種有益作用；目前熱量限制對(duì)勃起障礙的治療作用越來(lái)越引起關(guān)注。LA等［9］發(fā)現(xiàn)，低熱量和低脂飲食有助提高陰莖勃起功能和體內(nèi)睪酮水平，但其機(jī)制尚需不明確。本研究首次發(fā)現(xiàn)熱量限制引起內(nèi)源性H2S增多是其主要機(jī)制之一。

表4 各組大鼠陰莖組織NOS表達(dá)比較（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

表4 各組大鼠陰莖組織NOS表達(dá)比較（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與損傷對(duì)照組比較，bP＜0.05；與熱量限制組比較，cP＜0.05

組別假手術(shù)組損傷對(duì)照組熱量限制組H2S組F值P值1周7.14±0.69 4.71±0.76a 5.85±0.69ab 6.00±0.58ab 14.872 0.000 2周7.28±0.49 3.57±0.53a 6.00±0.57ab 6.28±0.49ab 63.478 0.000 4周7.42±0.53 2.71±0.76a 6.29±0.49ab 6.43±0.48ab 58.233 0.000 12周7.57±0.53 2.29±0.95a 6.57±0.53ab 6.71±0.76ab 77.116 0.000

圖2 免疫組化法檢測(cè)大鼠陰莖組織中NOS表達(dá)（×400）Fig.2 The expression of NOS in cavernous body by immunohistochemical method（× 400）

研究表明［4］熱量限制可通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)硫作用引起內(nèi)源性H2S增多。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，H2S由含硫氨基酸在—胱硫醚-β-合酶和胱硫醚-γ-裂合酶轉(zhuǎn)硫作用下產(chǎn)生；是一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，具有神經(jīng)保護(hù)等多種作用。SARUKHANI等［10］發(fā)現(xiàn)H2S能抗6-羥基多巴誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，具有明顯的抗帕金森和神經(jīng)保護(hù)作用。H2S還可作用于ATP敏感性鉀離子通道舒張血管平滑肌，與睪酮及NO協(xié)同作用舒張陰莖海綿體平滑肌，從而促進(jìn)陰莖勃起［7］。本研究顯示：熱量限制可以引起內(nèi)源性H2S水平增多，給予外源性H2S也有相似作用；熱量限制組和H2S組的海綿體神經(jīng)軸突數(shù)多于損傷對(duì)照組且逐漸增多，而損傷對(duì)照組逐漸減少。本研究率先證實(shí)熱量限制既可引起H2S水平增多又可促進(jìn)損傷的海綿體神經(jīng)修復(fù)，這表明熱量限制可通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性H2S水平增多，從而促進(jìn)海綿體神經(jīng)損傷修復(fù)；這可能是其對(duì)治療海綿體神經(jīng)損傷大鼠勃起功能障礙的主要機(jī)制之一。研究表明［4-5，11］熱量限制引起內(nèi)源性硫化氫增多是其多種有益作用的主要機(jī)制；本研究結(jié)果與其相符。

陰莖海綿體組織中NOS主要由神經(jīng)型NOS產(chǎn)生［12］，是催化L-精氨酸分解產(chǎn)生在陰莖勃起過(guò)程中起決定作用的遞質(zhì)NO的關(guān)鍵酶，其活性高低可反映陰莖的勃起功能，勃起功能障礙與陰莖組織NOS活性的下降有關(guān)［13］。目前關(guān)于海綿體神經(jīng)再生的研究也常常通過(guò)檢測(cè)陰莖背神經(jīng)中NOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維表達(dá)來(lái)間接反映海綿體神經(jīng)纖維的再生情況［14］。本研究發(fā)現(xiàn)損傷對(duì)照組NOS表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，而熱量限制和外源性H2S均可促進(jìn)陰莖海綿體NOS表達(dá)。這表明，熱量限制和外源性H2S均可促進(jìn)遞質(zhì)NOS產(chǎn)生，并促進(jìn)海綿體神經(jīng)再生，從而改善勃起功能。

前列腺氬氦刀冷凍消融術(shù)由于療效確切，創(chuàng)傷小；成為前列腺癌的可選擇治療方法之一［15-16］。勃起功能障礙是其術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，術(shù)中冷凍冰球損傷支配陰莖勃起的血管神經(jīng)束是術(shù)后發(fā)生勃起功能障礙的主要原因［17］。目前多采用術(shù)后早期口服5型磷酸二酯酶抑制劑治療，但因無(wú)法修復(fù)損傷的血管神經(jīng)束，療效欠佳。本研究發(fā)現(xiàn)熱量限制可促進(jìn)海綿體神經(jīng)再生，從而改善勃起功能；這為前列腺癌氬氦刀冷凍消融術(shù)后勃起功能障礙提供新思路。

本研究存在不足之處，雖然本研究證實(shí)熱量限制可促進(jìn)海綿體神經(jīng)損傷大鼠勃起障礙康復(fù)，但是由于本研究觀察時(shí)限最長(zhǎng)只到12周，其長(zhǎng)期療效尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，熱量限制通過(guò)引起內(nèi)源性H2S水平升高促進(jìn)大鼠海綿體損傷神經(jīng)修復(fù)和陰莖海綿體NOS表達(dá)，從而促進(jìn)海綿體神經(jīng)損傷大鼠勃起障礙康復(fù)。