順鉑聯合他莫昔芬對卵巢癌A2780細胞增殖及凋亡的影響

王成雙 佐滿珍

1青島市中心醫院，青島大學第二臨床醫學院腫瘤婦科（山東青島 266042）；2宜昌市第一人民醫院，三峽大學人民醫院婦產科（湖北宜昌 443000）

卵巢癌是常見的婦科生殖系統惡性腫瘤之一，其病死率占各類婦科腫瘤之首，且有逐年增加的趨勢［1］。大多數卵巢癌患者初次診斷即為晚期，2009年FIGO分期Ⅲ期或Ⅳ期的患者5年生存率分別為28%和16%［2］。目前腫瘤細胞減滅術聯合輔助化療依然是治療卵巢癌的重要手段，而順鉑和卡鉑等鉑類藥物是目前卵巢癌一線化療的抗腫瘤藥物，其細胞毒性作用主要通過進入細胞與DNA結合，導致其鏈內和鏈間交叉聯結，繼而使單鏈或雙鏈DNA斷裂，這種DNA損傷在無法修復的情況下可以導致細胞凋亡。鉑類藥物還可引起線粒體損傷，降低ATP酶活性導致細胞死亡［3］。多種因素參與了卵巢癌的發生［4-5］，研究證實，雌激素受體表達增加會抑制細胞凋亡，促進癌細胞增殖，并對化療產生耐藥［6-7］。

順鉑（DDP）具有廣泛的抗腫瘤譜，在耐鉑類藥物的卵巢癌細胞中發現雌激素受體表達顯著增加，提示其可能與鉑類藥物耐藥有關［8］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是經典的雌激素受體拮抗劑，近年來發現，用他莫昔芬處理乳腺癌細胞，可發生細胞漿濃縮、染色質凝聚、DNA斷裂等形態學改變。DDP聯合TAM對卵巢癌細胞的作用目前研究較少，本課題研究了DDP聯合TAM對A2780細胞增殖抑制、凋亡、細胞周期的影響，以期為基礎和臨床研究提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 人卵巢癌A2780細胞株由華中科技大學藥理實驗室贈送，由三峽大學醫學院凍存傳代，于37℃，5%CO2培養。

1.1.2 主要藥品、試劑 注射用順鉑購自山東齊魯制藥有限公司；枸櫞酸他莫昔芬（純度＞99.00%）購自大連美侖生物技術有限公司；進口胎牛血清購自上海原創生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍、DMEM培養基、Annexin V/PI試劑盒均購于美國Gbico公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測DDP及TAM對人卵巢癌細胞株A2780抑制率 實驗分3個處理組：空白組（只含培養液，無細胞及藥物處理）、對照組（正常培養細胞，但無藥物處理）及藥物組（正常培養細胞，并予以藥物處理）。胰酶消化對數生長期的A2780細胞，接種于96孔培養板，每孔2×103個細胞，24 h后更換培養液，以DMEM培養液配制藥品，使DDP終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL；TAM終濃度分別為1× 10-6、1× 10-5、2.5× 10-5、5× 10-5、7.5× 10-5、2× 10-4mol/mL；取3個檢測點（24、48、72 h），6復孔/組，培養后每孔加入20 μL濃度為50 mg/mL MTT溶液，培養4 h后棄掉上清液，每孔加入150 μL DMSO避光震蕩10 min，待沉淀溶解后，于酶標儀490 nm波長處測定OD值，各組取平均值。細胞抑制率（%）=1-藥物組OD/對照組OD×100%。根據半數抑制濃度計算軟件計算IC50。

1.2.2 Hoechst染色檢測A2780細胞凋亡 胰酶消化重懸對數生長的A2780細胞，用臺盼藍染色，調整細胞濃度為2×104個/mL。將蓋破片置于六孔板內，種入細胞4×104個，培養過夜，使細胞50%～80%融合。用藥物處理A2780后除去培養液，根據Hoechst 33258試劑盒說明書操作。

1.2.3 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期 胰酶消化對數生長期的A2780細胞，接種于25 mL2培養瓶中，每瓶4×104個細胞，培養融合至70%～80%，給藥后繼續培養72 h，制備單細胞懸液，后按Annexin V/PI試劑盒說明書操作，記錄細胞周期各時相百分比。

1.3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，組內及組間兩兩比較采用LSD法；當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同藥物濃度、不同作用時間時卵巢癌A2780細胞抑制率

2.1.1 不同藥物濃度DDP對A2780細胞的抑制率 以MTT法檢測不同藥物濃度DDP及在24、48、72 h三個時間點對A2780細胞的抑制率，不同藥物濃度在不同時間點對A2780細胞的生長的抑制存在差異，72 h的抑制率明顯高于24 h及48 h（P＜0.01），因此，以72 h濃度—抑制率曲線為標準，求得DDP的IC50為2.80 μg/mL。見圖1。

2.1.2 不同藥物濃度TAM對A2780細胞的抑制率 以MTT法檢測不同藥物濃度TAM在24、48、72 h三個時間點的細胞抑制率，結果顯示，不同藥物濃度在不同時間點對卵巢癌A2780細胞的生長表現出不同的抑制效果，其中，72 h的抑制率高于24 h及48 h（P＜0.05），因此，選擇72 h濃度—抑制率曲線為標準，求得TAM的IC50為2.25×10-5mol/L（12.69 μg/mL）。見圖2。

圖1 不同濃度、時間順鉑作用于卵巢癌A2780細胞抑制率Fig.1 Inhibition of different concentration and duration of DDP on A2780 cells′proliferation

圖2 不同濃度、時間他莫昔芬作用于卵巢癌A2780細胞抑制率Fig.2 Inhibition of different concentration and duration of TAM on A2780 cells′proliferation

2.2 DDP聯合TAM對A2780細胞凋亡的形態學觀察（Hoechst染色×200） 與對照組相比，給藥組細胞出現胞漿濃縮，胞核致密濃縮，呈碎塊狀，顏色變白等形態學改變。于每幅圖中隨機選取5個視野，進行活細胞計數，結果顯示，與對照組相比，給藥組存活細胞數量顯著減少（P＜0.01），且組間比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1、圖3）。

圖3 順鉑聯合他莫昔芬對細胞凋亡的形態學觀察（Hoechst染色×200）Fig.3 Effect of DDP and TAM on cell apoptosis（Hoechst staining × 200）

表1 順鉑、他莫昔芬對細胞存活情況的影響Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

表1 順鉑、他莫昔芬對細胞存活情況的影響Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

注：A，順鉑組；B，他莫昔芬組；C，順鉑聯合他莫昔芬組；D，正常對照組。**P＜0.01，與對照組相比；#P＜0.05，組間比較

組別 復孔A B C D 5 5 5 5細胞數目82.4±2.41**#88.6±4.93**#63.2±2.95**#193.8±5.63

2.3 流式細胞術檢測各組處理對A2780細胞周期的影響 細胞周期分布發生明顯改變，與對照組（4）相比，順鉑（A）及他莫昔芬（B）均使A2780細胞周期停滯于G0/G1期（P＜0.05，P＜0.01）（表2、圖4）。

3 討論

圖4 順鉑、他莫昔芬對細胞周期的影響Fig.4 Effect of DDP and Cinobufacini on cell cycle

表2 順鉑、他莫昔芬對細胞周期的影響Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

表2 順鉑、他莫昔芬對細胞周期的影響Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

注：A，順鉑組；B，他莫昔芬組；C，順鉑聯合他莫昔芬組；D，正常對照組。與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別A B C D n 3 3 3 3 G0/G1期67.48±4.85*72.3±4.16**39.37±5.21**58.37±2.65 S期+G2/M期32.52±4.85*27.7±4.16**60.63±5.21**41.63±2.65

約70%的卵巢癌發現時即為晚期，經過系統的手術分期或滿意的減瘤術及輔助化療，仍有70%的卵巢癌患者在2年內復發［9-10］，復發性卵巢癌對鉑類化療耐藥，直接威脅到卵巢癌患者的生存。雌激素是卵巢癌的發病因素之一，研究表明，絕經后的卵巢癌患者體內雌激素水平較前明顯增高［11］，雌激素與受體結合可促進細胞增殖，增強腫瘤細胞的侵襲及遷移。雌激素受體分α和β兩個亞型，α受體可促進細胞有絲分裂，進而促進細胞生長，β受體恰好相反。使用α受體拮抗劑或者β受體激動劑處理卵巢癌細胞，可明顯抑制細胞的生長［7］。NCCN推薦用于卵巢癌治療的抗雌激素藥物有兩種，即選擇性雌激素調節劑SERMs和芳香化酶抑制劑，常用的雌激素受體拮抗劑他莫昔芬及雷洛昔芬皆隸屬于前者。他莫昔芬可與雌激素競爭受體結合形成復合物，改變雌激素受體的空間構型，進而抑制癌細胞活性，抑制其生長。本實驗證實他莫昔芬能促進細胞凋亡，使腫瘤細胞周期停滯于G0/G1期，減少S期細胞的比例（P＜0.01），其對細胞周期的影響甚至優于順鉑（P＜0.05），形態學表現為胞漿及胞核濃縮，呈碎塊狀，顏色較正常細胞變白。他莫昔芬抑制A2780的基礎實驗效果可見一斑，而STASENKO等［12］的臨床研究證實，他莫昔芬可延長難治性卵巢癌患者的無進展生存期（progression?free survival，PFS）。另一項隨機對照研究，以82例口服他莫昔芬（40 mg qd）患者與156例行紫杉醇（80 mg/m2，每周）或阿霉素（40 mg/m2，每4周）化療患者相比，PFS有統計學差異，但OS卻無明顯差別［13］。這顯然為不能耐受化療毒性反應的晚期或難治性卵巢癌患者提供了新的治療選擇。

當順鉑與他莫昔芬聯合應用時，對細胞生長的抑制作用是毋庸置疑的（P＜0.01），本課題組發現，細胞周期的角度來看，腫瘤細胞S期比例上升，G0/G1比例減少，這顯然提示順鉑聯合他莫昔芬聯合用藥時其抑制細胞生長并不是單獨的疊加效應。國內研究表明，順鉑可促進卵巢癌細胞表達雌激素受體，雌激素受體拮抗劑可減輕順鉑耐藥［8］，究竟雌激素受體如何逆轉順鉑耐藥，其機制尚不清楚，余波瀾等［14］的研究表明，雷洛昔芬的衍生物阿佐昔芬及其體內代謝產物去甲阿佐昔芬均可形成醌類代謝物，與谷胱甘肽相結合后能抑制谷胱甘肽轉移酶的活性。由此推測，或可逆轉順鉑耐藥。然而，尚缺乏他莫昔芬減輕順鉑耐藥的相關機制研究，需要廣大學者進一步研究證實。