膀胱癌YAP表達及YAP對膀胱癌干細胞特性的影響

楊勇 姜睿

1西南醫科大學附屬醫院泌尿外科（四川瀘州 646000）；2遂寧市第一人民醫院泌尿外科（四川遂寧629000）

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統腫瘤中最常見的惡性腫瘤，近年來發病率和病死率都呈升高的趨勢［1］。目前對淺表性膀胱癌多采取手術治療的方式，但膀胱癌具有易復發、侵襲轉移等特點，導致膀胱癌的治療仍然是難點［2］。近年來膀胱癌干細胞的發現對于膀胱癌治療提供新思路，靶向治療膀胱癌干細胞對于有效根治膀胱癌至關重要，積極尋找調節膀胱癌干細胞特性的蛋白分子仍是目前研究熱點。

Yes相關蛋白（YAP）是Hippo信號通路中的重要組成部分，在細胞內起到信號轉導和轉錄共激活的作用［3］。Hippo?YAP信號通路是眾多調節膀胱癌信號通路中一條重要的通路。YAP的異常表達與膀胱癌的發生發展、侵襲轉移以及凋亡轉移密切相關［4］。此外，YAP蛋白可以促進腫瘤干細胞干性相關基因活化，表明YAP在腫瘤干細胞中起到重要作用［5］，然而YAP與膀胱癌干細胞之間的關系仍未報道。

本研究通過比較正常膀胱上皮細胞及膀胱癌細胞YAP蛋白及mRNA表達差異，驗證YAP在膀胱癌干細胞干性維持中的作用，為膀胱癌治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常膀胱上皮細胞SVHUC?1和人膀胱癌細胞株T24、253J、5637購自中國科學院昆明細胞庫；DMEM培養基和RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列BI公司；YAP過表達慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；CD133單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，YAP抗體購自美國CST公司，Nanog抗體和Oct?4抗體購自美國abcam公司，GAPDH抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 細胞培養和慢病毒轉染 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養基（青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 IU/mL），置于37℃、體積分數為5%的CO2細胞培養箱中培養。2～3 d更換培養基，待細胞生長貼滿培養皿，使用0.25%胰酶消化傳代。T24細胞正常培養傳代，YAP過表達慢病毒預實驗感染確定T24細胞病毒轉染MOI值。細胞計數按照1.0×105/孔接種于6孔板中，轉染前用PBS清洗細胞，Complete Mdeium稀釋polybrene至50 μg/mL，細胞加入polybrene和病毒，轉染細胞48 h后使用2～3 μg/mL嘌呤霉素細胞篩選2～3周，熒光顯微鏡下檢測熒光蛋白表達，Western blot和qRT?PCR檢測YAP蛋白和mRNA表達情況。

1.3 平板克隆實驗 取對數生長期的細胞以1 000個/孔接種于6孔板中，置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養。5～7 d后顯微鏡下觀察克隆形成情況并終止培養，棄去培養基，用PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后結晶紫染色30 min，緩慢沖洗后空氣干燥，拍照并計數克隆數目。

1.4 Western blot分析 將處于對數期的細胞消化離心后，制成細胞懸液并進行細胞計數，以2×105/孔接種于6孔板中，置于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養，待細胞生長貼壁后取出并用4℃的PBS沖洗3次，每孔加入150 μL細胞裂解液（RIPA）裂解細胞，將刮下的細胞吸入離心管中渦旋震蕩30 s，冰上靜置10 min，于4℃離心機15 000 r/min高速離心15 min，收集上清液中的總蛋白。吸取5 μL上清液做蛋白定量，余下上清液中加入6×Loading buffer在沸水中煮沸10 min。每組吸取30 μg蛋白進行SDS?PAGE凝膠電泳分離，并轉膜到PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h，加入一抗抗體4℃孵育過夜，經TBST洗膜液10 min×3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗膜液10 min×3次，使用ECL化學發光法顯影。目的蛋白通過與內參蛋白GAPDH標準化后得到相應比值。

1.5 qRT?PCR 對數期細胞進行消化離心后，細胞傳代于6孔板中，待細胞生長至60%～70%時按照Trizol法提取RNA。提取的RNA吸取2 μL做RNA定量，同時通過反轉錄得到穩定的cDNA模板，反轉錄體系參照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix試劑說明書。檢測使用TaKaRa SYBR@PrimixEx TaqTMⅡ反應體系，YAP上游引物序列為：5′?TAG?CCCTGCGTAGCCAGTTA?3′，下游引物序列為：5′?TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT?3′。CD133上游引物序列為：5′?AGTCGGAAACTGGCAGATAGC?3′，下游引物序列為：5′?GGTAGTGTTGTACTGGGCCA?AT?3′。Nanog上游引物序列為：5′?TTTGTGGGC?CTGAAGAAAACT?3′，下游引物序列為：5′?AGGG?CTGTCCTGAATAAGCAG?3′。Oct?4 上游引物序列為：5′?CTGGGTTGATCCTCGGACCT?3′，下游引物序列 為 ：5′?CCATCGGAGTTGCTCTCCA?3′。 使 用GAPDH作為內參，上游引物序列為：5′?GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT?3′，下游引物序列為：5′?GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG?3′。mRNA 的表達水平采用2?△△Ct計算方法進行分析。

1.6 統計學方法 使用軟件SPSS 18.0進行統計分析，計量資料以x±s表示，各組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本均數間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常膀胱上皮細胞及膀胱癌細胞系YAP表達情況 提取正常膀胱上皮細胞SVHUC?1及膀胱癌細胞系T24、253J、5637蛋白和mRNA，通過West?ern blot和qRT?PCR檢測YAP表達變化，結果發現YAP蛋白（圖1A）和mRNA（圖1B）在膀胱癌細胞系T24、253J、5637相對正常膀胱上皮細胞SVHUC?1高表達。

圖1 YAP蛋白及mRNA在正常膀胱上皮細胞及膀胱癌細胞系表達情況Fig.1 Expression of YAP protein and mRNA in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cell lines

2.2 構建T24 YAP過表達細胞系 YAP蛋白在膀胱癌細胞系T24中相對253J和5637低表達，因此應用YAP過表達慢病毒感染T24細胞，構建YAP過表達細胞系，通過顯微鏡下觀察（圖2A），qRT?PCR和Western blot檢驗YAP mRNA（圖2B）和蛋白（圖2C和圖2D）表達，驗證成功構建YAP過表達T24細胞系。

圖2 構建T24 YAP過表達細胞系Fig.2 T24 YAP overexpression cell lines were constructed

2.3 YAP過表達后膀胱癌細胞干細胞特性增強 提取T24過表達細胞系蛋白及mRNA，檢測干細胞標志物CD133、Nanog和Oct?4表達，結果發現YAP過表達后干細胞標志物蛋白水平（圖3A）和mRNA水平（圖3B）均明顯上調；過表達細胞系進行平板克隆實驗，結果發現YAP過表達后平板克隆體積增大、數量增多（圖3C和圖3D），差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

膀胱癌由于其高復發率和高侵襲轉移能力，在泌尿系統腫瘤中嚴重影響人們的身體健康，成為導致患者死亡的重要原因。近年來，隨著對腫瘤干細胞研究的深入，認為腫瘤干細胞具有類似正常組織干細胞的特點，腫瘤干細胞具有自我更新、自我增殖及多向分化的能力［6］。同時，膀胱癌干細胞的存在，對維持膀胱癌的發生發展、增殖及侵襲轉移起著重要的作用。

腫瘤干細胞是一群具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細胞群，在腫瘤的發生發展、復發轉移以及多重耐藥中發揮重要功能［7］。近年來泌尿系腫瘤干細胞相關研究取得了很顯著的成果，YANG等［8］發現膀胱癌干細胞可能源自上皮基底干細胞的突變或非干細胞膀胱癌細胞的突變形成。目前膀胱癌干細胞表面分子標記物研究取得長足進步，如CD133、Nanog、Oct?4、Sox 2和ALDH1等［9］，本研究中采用CD133、Nanog和 Oct?4 進行檢測，用于驗證YAP改變對膀胱癌干細胞特性的影響。

圖3 T24 YAP過表達干細胞特性增強Fig.3 YAP enhanced stem cell characteristics of bladder cancer cells

Hippo?YAP信號通路在腫瘤干細胞中對腫瘤的干性維持起著重要的作用［10］。YAP在人體正常組織如上皮、肌肉等中有一定量的表達，但是在惡性腫瘤如肝癌［11］、乳腺癌［12］、前列腺癌［13］和腎癌［14］等中，YAP的表達水平明顯升高。有學者研究發現YAP在肝癌中是維持肝癌干細胞干性的主要調節因子［15］，在卵巢癌的研究中發現當抑制YAP后，卵巢癌干細胞的增殖能力和細胞克隆形成能力降低；當YAP過表達后卵巢癌干細胞的增殖能力和克隆形成能力加強［16］。然而，在膀胱癌中關于YAP對膀胱癌干細胞的影響卻未見報道，本研究主要探討YAP在膀胱癌干細胞中發揮的作用。通過Western blot和qRT?PCR發現YAP蛋白和mRNA在膀胱癌細胞系相對正常膀胱上皮細胞高表達，提示YAP可能是膀胱癌腫瘤發生的重要因素。慢病毒轉染構建膀胱癌YAP過表達細胞系，并使用顯微鏡下觀察熒光蛋白表達、Western blot和qRT?PCR檢測YAP蛋白驗證YAP過表達細胞系成功構建。為了驗證YAP在膀胱癌干細胞特性中發揮的功能，本研究檢測YAP過表達后干細胞標志物 CD133、Nanog和 Oct?4 表達改變，發現YAP 過表達后 CD133、Nanog和 Oct?4表達上調。同時使用平板克隆實驗，發現YAP過表達后膀胱癌干細胞特性增強。

綜上所述，YAP在膀胱癌細胞中表達上調，有可能是膀胱癌發生發展的重要分子，同時YAP水平改變對膀胱癌干細胞干性維持起到重要作用。本研究為膀胱癌靶向治療提供新靶點，為提高膀胱癌的總體治療水平和預后起到重要作用。