4-羥苯基維胺對瘢痕疙瘩成纖維細胞ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA表達的影響

南美蘭 金玟言 金哲虎 金承龍

延邊大學附屬醫院皮膚科（吉林延吉 133000）

瘢痕疙瘩（keloid）是人體皮膚創傷后異常修復的結果［1-2］，真皮部位以成纖維細胞為主的細胞過度增殖，合成大量膠原、纖維連接蛋白及糖蛋白，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成與降解失去平衡，造成瘢痕形成異常［3］。

Ⅰ型膠原是ECM中最主要的成分之一，除自身的生理支持作用外，還可調節細胞的遷移與增殖，是創面愈合和瘢痕形成的關鍵因素。瘢痕疙瘩主要表現為Ⅰ型膠原特異性表達升高，在對治療瘢痕疙瘩有效藥物的深入研究中，大多離不開對膠原基因表達的影響?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及金屬蛋白酶組織抑制物（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs）是調節ECM成分合成和降解的重要分子［4-5］?；|金屬蛋白酶-1（matrix metallo?protein?1，MMP?1）是MMPs家族的重要一員，在創傷愈合過程中對啟動膠原的降解起著關鍵作用，是Ⅰ型膠原降解的關鍵酶。

4-羥苯基維胺（4?hydroxyphenyl?retinamide，4?HPR）是人工合成的全反式維甲酸，在體外實驗中對多種惡性腫瘤細胞有較高的抗腫瘤活性，且毒性低于其他維甲酸類藥物［6］。因瘢痕疙瘩具有腫瘤的生物學特性［7］，筆者推測 4?HPR也可用于瘢痕疙瘩的治療。

前期研究中筆者發現，在人瘢痕疙瘩成纖維細胞中，4?HPR可以抑制Ⅰ型前膠原（typeⅠ pro?collagen，ProcollagenⅠ）及上調MMP?1蛋白的表達。為此，筆者本次進一步利用實時熒光定量PCR方法，探討在RNA水平上，4?HPR的干預下對瘢痕疙瘩成纖維細胞產生的ProcollagenⅠ及MMP?1表達的影響。進一步明確4?HPR對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用機制，為瘢痕疙瘩的發病機制和治療提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 胎牛血清（Corning公司）、DMEM培養液（Corning公司）、Ⅱ型膠原酶（Gibco公司）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ染料法熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）、4?HPR（南京圣賽化工有限公司）、二甲基亞砜（Sigma公司）。CO2細胞培養孵育箱（Thermo Fisher Scientific公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、PCR儀器（Life Technologies公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人瘢痕疙瘩及正常真皮成纖維細胞的原代培養 成纖維細胞來源于瘢痕疙瘩組織（臨床病理證實，已取得了患者知情同意，未接受局部外用藥物、注射及放射治療且無其他自身免疫性疾病及慢性器質性疾?。┘罢Ｆつw組織（已取得了患者知情同意，而且所取標本的顏色和形態均正常，無瘢痕、炎癥及其他病變）。將臨床切取的標本在無菌條件下經漂洗、消毒，放入干燥的無菌培養皿中，切成1 cm×1 cm大小的碎片，放入含2 mL胰酶的離心管中4℃冷消化。冷消化24 h、熱消化15～20 min后，遂將離心管內胰酶和組織一同倒入培養皿內，輕輕撕去表皮。將已去除表皮的皮片剪碎至1 mm×1 mm左右大小，加入2～3 mLⅡ型膠原酶，置入CO2恒溫培養箱中，消化5～7 h。取上清液移至另一離心管中離心，去上清，加入原代培養基吹打混勻，轉入到25 cm2的培養瓶中，放入CO2恒溫培養箱中培養。次日觀察，可觀察到大量貼壁多角型細胞和黑色組織碎屑，碎屑周圍有細胞爬出，且細胞呈長梭形，給細胞換液，用PBS液將碎屑沖洗干凈，然后加入培養液在上述條件下繼續培養細胞，每日換液，待細胞基本鋪滿瓶底后，且生長成致密單層時，可進行傳代培養。取6～8代細胞用于實驗。

1.2.2 藥物配制 稱取20 mg 4?HPR，加入1 mL DMSO溶解，-20℃避光保存備用，實驗時用DMEM培養液稀釋至相應濃度。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測瘢痕疙瘩和正常成纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達水平 35 mm培養皿培養的細胞待80%～90%融合，消化、離心、徹底棄上清液，每孔加0.5～1.0 mL Trizol，混勻，室溫放置5 min使細胞充分裂解，收集細胞和裂解液。每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿，混勻，靜置5 min抽提RNA，4℃，15 000 r/min，離心15 min。小心取水相RNA溶解層，加0.5 mL異丙醇，混勻后靜置10 min，沉淀RNA，4℃，15 000 r/min，離心10 min。棄上清，加1 mL的70%乙醇洗滌，4℃，15 000 r/min，離心5 min。棄上清，開蓋自然干燥后加入15～30 μL無RNase的DDW，溶解RNA。用超微量核酸定量儀直接測定核酸濃度，加2 μL RNase free DDW于點樣板進行調零，加2 μL RNA原液測量，程序算出樣品的260、280、230 nm的吸光度和RNA濃度、A260/A280及A260/A230，導出結果，標記、-80℃保存。按試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，目的基因ProcollagenⅠ、MMP?1和內參GAPDH基因同時進行PCR擴增。目的基因Pro?collagenⅠ、MMP?1和內參GAPDH基因的引物序列設計經基因庫查詢，均由上海Invitrogen有限公司合成，序列見表1。PCR擴增反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性22 s，58℃退火1 min，共40個循環。反應結束后采用2?△△CT法計算相對表達量，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。

表1 引物序列、退火溫度及產物長度Tab.1 Primersequences，annealing temperatures and products size of target genes

1.2.4 不同濃度4?HPR對瘢痕疙瘩纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1mRNA表達水平的影響對照組加入DMEM培養液，實驗組分別以1、3、6 μmol/L的4?HPR溶液加入長滿90%的瘢痕疙瘩成纖維細胞（饑餓24 h）中，分別作用24 h后，抽提RNA，進行相關檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，樣本比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代培養瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細胞生長形態觀察結果 成纖維細胞第5～8天開始見有少量細胞開始從組織中游出，并逐漸增多，直至第20～30天細胞可基本長滿培養瓶底可進行傳代。瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細胞在倒置顯微鏡下觀察，其形態上無明顯差異。見圖1。

圖1 顯微鏡下成纖維細胞形態（×10）Fig.1 Morphology of fibroblasts observed under inverted micro?scope（× 10）

2.2 瘢痕疙瘩和正常成纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1mRNA的表達水平 結果示瘢痕疙瘩成纖維細胞中ProcollagenⅠmRNA表達明顯高于正常皮膚成纖維細胞，差異有統計學意義（t=2.88，P＜0.05），而瘢痕疙瘩成纖維細胞中MMP?1mRNA表達低于正常皮膚成纖維細胞，且差異有統計學意義（t=2.22，P＜0.05）。見圖2。

圖2 成纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達Fig.2 The expression of Procollagen Ⅰand MMP?1 mRNA in fibroblasts

2.3 不同濃度4?HPR作用下瘢痕疙瘩成纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA表達的比較在原代培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞中，不同濃度的4?HPR藥物處理組（實驗組）中，隨著濃度的增高ProcollagenⅠmRNA表達水平較對照組明顯減少，即4?HPR對ProcollagenⅠmRNA表達呈明顯的量效抑制，6 μmol/L時作用最強，且組間比較差異有統計學意義（t1=3.18，P1＜ 0.05；t2=3.87，P2＜0.05；t3=5.34，P3＜ 0.05）。而 MMP?1 mRNA 表達水平，隨著4?HPR藥物濃度的增高較對照組明顯增加，6 μmol/L藥物濃度時作用最強，組間比較差異有統計學意義（t1=5.18，P1＜ 0.05；t2=5.60，P2＜ 0.05；t3=7.86，P3＜ 0.01）。見圖3。

圖3 比較4?HPR不同濃度對瘢痕疙瘩成纖維細胞中ProcollagenⅠ和MMP?1 mRNA的表達Fig.3 Comparing the expression of ProcollagenⅠand MMP?1 mRNA in keloid fibroblasts in different concentrations of 4?HPR

3 討論

瘢痕疙瘩是皮膚創傷的過度修復，是人類特有的一種良性皮膚纖維增殖性腫瘤，以細胞因子活性異常增強和產生大量的ECM為主要組織學特點，發病機制尚不完全清楚［8-9］。最顯著的特征表現為膠原、纖維連接蛋白和蛋白糖原等ECM過度合成，降解減少，在局部大量沉積。

本研究結果表明，在原代培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞中，ProcollagenⅠ的基因表達明顯高于正常皮膚成纖維細胞（P＜0.05），而此類型前膠原屬于原纖維化膠原類，ProcollagenⅠ基因表達升高導致其蛋白含量增多，可能是瘢痕疙瘩形成的原因之一，其作用可能與其他類型膠原的聚集以及膠原纖維與胞外基質作用有關。

近年來，膠原蛋白合成與降解間的失衡在瘢痕疙瘩發病機制中的作用引起重視，隨之關于瘢痕疙瘩成纖維細胞中MMPs家族的檢測也成為研究的熱點課題。MMPs是一群因具有蛋白水解酶活性參與降解基底膜和ECM過程的家族。MMPs家族按作用底物的特異性和在細胞內的位置進行分類，已被發現的成員有5大類，均具有相對保守的基因結構和酶活性。MMP?1為其家族成員之一，它可以在創傷修復中Ⅰ型前膠原a1和a2鏈的特殊部位降解膠原，是降解膠原纖維最主要的基質金屬蛋白酶。筆者在本次研究中，用實時熒光定量PCR方法分析MMP?1基因表達結果顯示，體外原代培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞中，其MMP?1 mRNA表達較正常皮膚成纖維細胞顯著降低（P＜0.05），結果與張鵬等［10］、UCHID 等［11］及龐久玲等［12］結論相符，提示可能瘢痕疙瘩成纖維細胞自身存在著MMP?1轉錄及/或翻譯水平的異常，致使瘢痕疙瘩成纖維細胞胞核、胞漿中MMP?1蛋白減少。

4?HPR是20世紀60年代美國開發合成的一種維甲酸衍生物。4?HPR已廣泛應用于多種腫瘤的體內外研究，在臨床試驗中亦顯示出良好的抗腫瘤作用，且人體對其有良好的耐受性［13-15］，是一種具有良好臨床應用前景的腫瘤預防和治療藥物。瘢痕疙瘩表現出向周圍正常皮膚組織侵襲性生長、無自愈傾向、單純手術切除后容易復發、對放療和化療敏感等類腫瘤特性［16-19］，且研究［20］顯示眾多腫瘤相關基因及細胞因子在瘢痕疙瘩的發生、發展過程中發揮著重要作用，這些都提示在瘢痕疙瘩的治療研究中可借鑒一些抗腫瘤的研究成果。本次研究，筆者用不同濃度的4?HPR處理原代培養的瘢痕疙瘩成纖維細胞，發現隨著濃度的增高，實驗組的ProcollagenⅠmRNA表達水平較對照組明顯減少，且組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），而實驗組的MMP?1 mRNA表達水平較對照組明顯增加，且組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），與筆者前期在蛋白水平上4?HPR對ProcollagenⅠ及MMP?1影響的研究結果相一致［21］。

本次研究表明，4?HPR能阻斷ProcollagenⅠmRNA表達或抑制其生物活性，且對MMP?1 mRNA有增強作用，達到實驗性治療瘢痕疙瘩的目的。而且，4?HPR具有濃度依賴性的降低瘢痕疙瘩成纖維細胞中的ProcollagenⅠmRNA及增加MMP?1 mRNA的表達，致使更有效地抑制成纖維細胞增殖，給瘢痕疙瘩的治療帶來較好的發展前景。