自然殺傷T細胞在血管緊張素II誘導的高血壓中的作用

侯翠柳 陳 東 來 松 劉 洋 田 翠 楊 慧 王紅霞

原發性高血壓(primary hypertension, PH)是以體循環動脈壓升高為主要臨床表現的心血管綜合征，通常簡稱為高血壓[1]。高血壓與其他心血管病危險因素共存，是重要的心腦血管疾病危險因素，可損傷重要臟器如心、腦及腎的結構和功能，最終導致這些器官功能的衰竭[2]。目前關于PH的發病機制尚不清楚，認為是遺傳、環境及神經內分泌因素共同作用的結果。近年來大量研究表明高血壓是一種慢性炎癥性疾病，且越來越多研究表明炎癥反應尤其是免疫細胞在高血壓及其靶器官損害的過程中具有重要的作用，如高血壓和高鹽可促進免疫細胞包括單核/巨噬細胞和T 淋巴細胞等在血管壁中聚集和活化，產生大量氧自由基(reacive oxygen speaes,ROS)和炎癥因子，進而促進血管重塑和高血壓發生[3]。Harrison實驗室發現RAG-1-/-小鼠(缺乏T和B淋巴細胞)可明顯抑制Ang II 和DOCA-salt誘導的高血壓，通過特異性過繼性T淋巴細胞轉移可完全恢復血壓，而B淋巴細胞沒有上述作用[4]。上述研究表明，T淋巴細胞介導的免疫反應參與高血壓的發生[5]，但何種類型的T淋巴細胞參與高血壓的發生目前尚不清楚。

自然殺傷T細胞(natural killer T cells, NKT)細胞是一類新的T細胞亞型，既表達T細胞受體(TCR)αβ，又表達NK細胞表面標志的T細胞亞群。其能識別由抗原提呈細胞表面CD1d分子提呈的脂類抗原如(α-GalCer)[6]，因此CD1d的敲除導致NKT細胞的失活。 NKT細胞活化后迅速分泌大量細胞因子從而調節機體的免疫應答，從而在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中發揮重要的作用[7]。除此之外，研究還發現NKT細胞還參與了多種心血管疾病的發生，如NKT細胞調節動脈粥樣硬化的發生、其激活保護心肌細胞免受柯薩奇病毒B3引起的心肌損傷、拮抗心肌缺血/再灌注和心肌梗死的發生等[8]，但其在高血壓發生發展中的作用尚不清楚。

本實驗通過在CD1d基因敲除的小鼠上，采用血管緊張素II灌注14 d建立小鼠高血壓模型，觀察小鼠血壓、血管壁厚度、炎癥反應及纖維化及巨噬細胞的浸潤，探討NKT細胞在高血壓中的作用及分子機制。

材料與方法

1.實驗動物 C57BL/6J小鼠，雄性，6 ～8周齡，18～20 g，由北京維通利華公司提供。CD1d基因敲除(CD1d knockout, CD1d ko)購自Jackson Laboratory小鼠(129S2/SvPas)。所有實驗動物均飼養于首都醫科大學 SPF 級實驗動物房。所有研究工作均遵守美國國立衛生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)制定的《實驗動物管理及使用指南》，并經首都醫科大學實驗動物管理委員會批準。

2.主要試劑 Angiotensin II、三溴乙醇、麗春紅粉劑、苯胺藍粉劑、磷鉬酸/磷鎢酸均購于美國Sigma公司；苦味酸、碳酸氫鈉購于北京化工廠；反轉錄試劑盒購于美國Progame公司；流式管，計數板、CD45-Perpcp抗體、F4/80-BV421抗體購于美國BD公司。

3.主要方法 (1)實驗分組、模型制備及給藥方法：CD1d 基因敲除(CD1d ko)及C57BL/6J野生對照雄性小鼠(wild type, WT)分別隨機分為 4 組(每組 8 只)：對照組WT+ Saline、CD1d ko+Saline；實驗組WT+Ang II、CD1d ko+Ang II。模型制備過程：小鼠稱重，計算 Ang II(490ng·min-1·kg-1)所需劑量，根據劑量在超凈臺下灌泵。用3%的三溴乙醇溶液腹腔注射麻醉小鼠，常規消毒實驗組小鼠耳后部皮膚，剪開1cm長的切口，將泵(開口端朝向鼠尾側)埋入淺筋膜下層。縫合皮膚，嚴密觀察小鼠生命體征，待小鼠生命體征平穩后隔天用無創鼠尾法監測小鼠血壓持續14 d。

(2)血管取材與染色：小鼠麻醉后打開胸腔進行心血管體循環系統灌注，剪取小鼠胸主動脈，用濾紙吸干血管表面的水分，用于提取 RNA的組織用液氮冷凍后保存于 -80 ℃冰箱。用于病理檢查的血管在甲醛中固定，然后石蠟包埋、切片，脫蠟后進行HE和Masson染色。

(3)實時熒光定量 PCR實驗：Trizol 法提取小鼠血管組織 RNA，反轉錄獲得 cDNA。每個體系加入 2 μL cDNA 模板、上下游引物各 1 μL 和 SYBR10 μL，配制成 20 μL 的反應體系。通過實時熒光定量 PCR 儀測定IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA水平。IL-1β 的上游引物為 5’-TTGGGCCT-CAAAGGAAAGAAT-3’，下游引5-TGGGTATT-GCTTGGGATCCA-3’; IL-6 的上游引物為 5’-CCA-GAAACCGCTATGAAGTTCCT-3’，下游5-AGAACCCTGACTACGACCAC-3’; TNF-α 的上游引物為 5’-GCCAACGGCATGGATCTC-3’，下游引物為 5-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGAG-3.

(4)流式細胞術：配制血管消化酶，剪取小鼠的整根主動脈，修剪血管周圍多余的脂肪組織，然后將血管放到裝有PBS的1.5mL EP管中，置于冰上剪碎小鼠的血管組織，每組的操作盡量保持一致性，隨后將剪碎的血管組織轉移至裝有消化酶的EP管中，不斷消化，直至血管組織被完全消化成單細胞懸液，過濾至新的15mL離心管中，除去其雜質。將上述過濾好的血管單細胞懸液 400g 離心 7min，棄上清，1mL PBS 重懸計數。標記流式抗體：將流式抗體加入細胞懸液中，4℃，避光孵育 30min；抗體孵育完成后，400g ，離心 7min，棄上清，加入 1mL PBS 重懸，再 400g， 離心 7min，用 500μL PBS 重懸細胞后上機檢測。

4.統計學處理 統計分析均使用 SPSS 19. 0 軟件。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.CD1d敲除加重 AngII灌注誘導的血壓升高 與Saline組相比，Ang II灌注后野生小鼠血壓明顯升高(P<0.05)，而CD1d基因敲除進一步增加Ang II灌注引起的血壓升高(P<0.05，圖1)。

圖1 CD1d基因敲除對 Ang II灌注引起血壓升高的影響。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比 較，#P<0.05

圖2 CD1d敲除對 Ang II灌注誘導的血管厚度和炎癥反應的影響。A： H&E染色檢測血管壁厚度(×200)；B：定量qPCR檢測血管組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α mRNA的表達水平。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P <0.05

圖3 CD1d敲除對 AngII 誘導的血管纖維化的影響。A：Masson 染色檢測血管組織中膠原沉積情況(×200；)B：及膠原面 積定量分析(右)(n=8)。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P<0.05

2.CD1d敲除加重Ang II誘導的血管壁厚度及炎癥反應 與 Saline組比較，Ang II 灌注明顯增加血管壁厚度及炎癥因子IL-1、IL-6和TNF-α mRNA的表達(P<0.05)，而CD1d基因的敲除進一步加重Ang II灌注引起的以上變化(圖2)。

3.CD1d敲除加重Ang II誘導的血管壁中膠原的沉積 與Saline組相比，Ang II 灌注明顯增加血管組織中膠原沉積，而CD1d敲除進一步加重Ang II 灌注引起的膠原沉積(P<0.05，圖3)。

4.CD1d敲除增加Ang II 誘導的血管壁中巨噬細胞浸潤 為了明確NKT是否調節血管組織中巨噬細胞的浸潤，我們應用流式細胞技術檢測了 CD45+F4/80+的巨噬細胞數量。結果表明與saline 組相比，Ang II 處理的 WT小鼠的血管中CD45+F4/80+的巨噬細胞明顯增多，而CD1d敲除進一步增加這些細胞的數量(P<0.05，圖4)。

討 論

本實驗發現Ang II灌注引起野生小鼠血壓升高、血管壁的厚度增加、炎癥因子mRNA的表達增加及血管中膠原纖維的沉積增多，而CD1d敲除加重了以上的變化，說明NKT細胞能夠拮抗Ang II灌注引起的血壓升高；進一步本實驗還發現CD1d敲除進一步加重了Ang II灌注引起的巨噬細胞浸潤。以上結果表明 NKT細胞通過調節巨噬細胞的浸潤參與了對高血壓的調節。

圖4 CD1d敲除對 Ang II 誘導的巨噬細胞影響。A：流式細胞術分析血管組織中CD45+F4/80+炎性細胞比率；B：統計分 析(n=8)。注：與 Saline 組比較，*P<0.05；與 Ang II組比較，#P<0.05

高血壓的發生過程涉及動脈血管結構和功能的異常改變，其主要病理改變包括血管壁增厚、平滑肌細胞增生/肥大、細胞外基質增多和炎癥細胞聚集。本實驗發現CD1d敲除導致NKT細胞不能活化，進一步加重了Ang II 灌注引起的血壓升高，血管壁厚度增加及膠原的沉積，首次證明了NKT細胞參與了高血壓的發生。NKT細胞激活后可產生Th1(如TNFα和IL-1β)和Th2型(如IL-4和IL-10)的細胞因子，這些細胞因子進一步影響先天性免疫和適應性免疫反應，包括NK細胞、抗原遞呈細胞、CD4+和 CD8+T 細胞以及巨噬細胞的激活。鑒于巨噬細胞是機體內重要的吞噬和抗原提呈細胞，在維持促炎與抑炎反應中起著重要的作用[9]。在脈管系統和腎臟中，巨噬細胞衍生的ROS和炎癥細胞因子可以導致內皮和上皮功能障礙，造成血管氧化應激和鈉排泄的損傷，最終導致高血壓等心血管疾病和腎臟疾病[10]。高血壓的誘因如Ang II、DOCA-salt等可促進骨髓來源單核巨噬細胞增多，造成血管內皮的功能障礙[11]。基于此，我們進一步探討了NKT細胞是否通過調節巨噬細胞從而參與對血壓的調節。結果發現CD1d分子敲除明顯加重了Ang II灌注誘導血管組織中CD45+的炎性細胞及巨噬細胞的增多，從而增加了血管的炎癥反應，提示NKT細胞可以通過減少巨噬細胞的浸潤而拮抗高血壓的發生。

總之，本研究發現CD1d敲除加重Ang II灌注引起的血壓升高、血管重塑包括血管壁厚度的增加和纖維化加重，并且加重了血管組織中巨噬細胞的浸潤，說明NKT通過調節巨噬細胞參與高血壓的發生。我們的結果為高血壓的治療提供一個新的靶點，但是NKT細胞是通過何種方式影響的巨噬細胞的聚集還有待我們的進一步研究。