響應面法優化垂盆草中總黃酮提取工藝的研究

韓濤　王瑞　馬俊杰　鄭賁　李長江

【摘 要】本文考查垂盆草中總黃酮的溶劑浸提工藝，以蘆丁為標準品，采用響應面（Box-Behnken）設計方法，對提取時間、溫度、料液比進行優化，結果：提取時間為60 min，以50℃為提取溫度，垂盆草與乙醇（76.8 %）料液比為1：15時，提取垂盆草中總黃酮的工藝最佳，總黃酮得率為17.1814 mg/g。實驗結果與模型預測值相符度高。

【關鍵詞】垂盆草；響應面法；總黃酮；提取工藝

中圖分類號： R284.2 文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2018）15-0026-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.15.012

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Sedum

Sarmentosum Bunge by Response Surface Methodology

HAN Tao WANG Rui MA Jun-jie ZHENG Ben LI Chang-jiang*

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Huangshan University， Anhui， Huangshang， 245041）

【Abstract】To optunize the extraction technology of total flavonoids from Sedum sarmentosum Bunge. The factors such as extraction temperature， material-liquid ratio and ethanol concentration were optimized by response surface methodology. The results show that the Box-Behnken design method is reliable.The highest extraction rate of total flavonoids by extraction could arrive at 17.1814 mg/g using extraction temperature 50 ℃， material-liquid ratio of 1：15， 76.8 % ethanol concentration， and extraction time 60 min， which was agreed with model predictions.

【Key words】Sedum sarmentosum Bunge；Response surface method；Total flavonoids；Extraction process

垂盆草為景天科植物，是一種具有觀賞性的中草藥，收錄在《中國藥典》2015 年版一部，利濕退黃、清熱解毒； 用于治療濕熱黃疸，小便不利，癰腫瘡瘍，急、慢性肝炎等[1]。從化學成分角度來看，垂盆草主要成分為黃酮類、氨基酸類、糖類、蛋白質、三萜類等，研究表明這些化學組分在臨床應用中有較好的生物學活性，其中垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶活性成分之一[2-4]。目前對垂盆草總黃酮的種類、藥理的研究很深入，但在提取工藝方面的研究還不夠深入，目前研究廣泛使用的是正交試驗法[5-8]。本文利用響應面設計方法[9，10]優化傳統的溶劑提取工藝參數，為垂盆草總黃酮類功效成分的開發利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

垂盆草購自安徽黃山同德仁藥鋪，蘆丁標準品購自國藥集團，其他試劑均購自阿拉丁試劑網。

UV-2600紫外可見分光光度計（島津儀器蘇州有限公司），FA2104B電子天平（上海越平科學儀器有限公司），XFB-1000中藥粉碎機（中誠制藥機械廠），移液槍（大龍興創實驗儀器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

配置4mg/mL的蘆丁標準品溶液（準確稱取蘆丁標準品16.00mg，然后加入60%乙醇定容到4mL），分別移取0.75mL，0.5mL，0.25mL和0.025mL的蘆丁標準品，分別用60 %的乙醇溶液將其定容到1mL，配置濃度為3mg/mL，2mg/mL，1mg/mL和0.1mg/mL的蘆丁標準品溶液。用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法[11]，分別吸取0.1mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL的蘆丁標準品各1mL加入10mL的具塞離心管中，各加入5%的NaNO2溶液0.4mL混勻后靜置5min，然后加入10%的Al（NO3）3溶液0.4mL混勻后靜置5min，最后加入4%的NaOH溶液4mL，定容后混勻靜置20min。用60 %的乙醇溶液做參比掃描基線，依次在最大吸收波長504nm（蘆丁標準品的最大吸收波長）處下測定各標準溶液的吸光度，如圖1-1，得出在504nm波長處測定吸光度，以樣品濃度對吸光度進行線性回歸，得到吸光度與濃度的回歸方程為y=1.0701x+0.0003，R=0.9989。從標準曲線可以看出，蘆丁對照品濃度在0～3mg/mL之間時與吸光度成較好的線性關系。

1.2.2 垂盆草總黃酮的提取和含量的測定

用電子天平準確稱取粉碎后的垂盆草2.0000g，稱取5份，分別倒入50 mL 的錐形瓶中，用不同濃度的乙醇溶液，在不同的溫度下，按照一定的料液比進行提取，提取結束后靜置離心，取清澈提取液，然后進行如 1.2.1 的顯色處理后測得吸光度，代入回歸方程，計算出總黃酮的提取率。

2 響應面設計實驗結果及分析

2.1 試驗設計

依照中心組合設計規律，綜合響應面分析方法，考慮單因素篩選實驗結果。以提取溫度（A），料液比（B），乙醇濃度（C）三個因素為自變量，以–1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平，按方程X1=（χ1-60）/10、X2=（χ2-20）/5、X3=（χ3-70）/20對自變量進行編碼，以總黃酮的提取量為響應值，設計三因素三水平共17個實驗點的響應面分析實驗，因子編碼及水平見表2-1。

2.2 二次響應面回歸模型的建立

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件設計試驗條件，采用Box-Behnken模型[12]，對表2-2的結果進行擬合，得到總黃酮的提取量對提取溫度（A），料液比（B），乙醇濃度（C）的二次多項回歸方程模型：

Y=14.19+0.31A-0.49B+1.47C-O.41AB-0.36AC-0.27BC+0.63A2+0.59B2-1.34C2 （i）

2.3 響應面回歸模型的方差分析

再次檢驗回歸方程的可靠性，進一步確定因素A，B，C對總黃酮提取量的影響程度，對回歸模型進行了方差分析，結果見表3-3。

觀察模型的F=13.26，P<0.001，差異顯著，即對總黃酮提取量的影響較為顯著。可以看出該擬合方程各因素與響應值之間的關系能與回歸方程很好擬合。把A，B，C帶入回歸方程模型，可以看到回歸系數p值均小于0.05。提取溫度、料液比和乙醇濃度均對提取總黃酮量有影響。

2.4 響應面分析

繪制響應面立體分析圖及等高線是把因素A，B，C帶入Design-Expert軟件依據回歸方程（i），觀察擬合響應曲面的形狀，結合提取條件對垂盆草總黃酮提取量的影響。分析響應面的情況。

我們知道因素的改變對響應值影響很大，觀察響應曲面坡度，可以看出坡度越陡，影響越明顯。而因素的改變越小，則響應面曲線越平緩 。從圖2-1～2-3可以看出各顯著性影響因素交互作用對響應值的影響，提取時間和料液比交互作用曲面如果越陡，表明對總黃酮提取量交互作用越明顯，反之，交互作用曲面越緩，表明對總黃酮提取量交互作用越不明顯。

2.5 最優條件的確定

為確定各因素的最佳取值，利用Design-Expert軟件中的Optimization的Numerical功能，在模型濃度范圍內選擇最低點為出發點，使用最大值優化，得提取垂盆草總黃酮的理論工藝：在提取時間60min下，反應溫度為50℃，垂本草和溶劑比為1：15，乙醇濃度為76.8%，得到的總黃酮的量為17.1814mg/g。為驗證響應面法的可行性，采用修正的最佳提取工藝：垂本草和溶劑比為1：15，在提取時間60min，反應溫度為50 ℃，乙醇濃度為75%的條件下進行優化實驗，實驗結果如表2-4。

從表中可以得出，該優化條件三次提取平均值偏差為1.05 %比理論值3 %小，說明實驗值與理論值有較好的擬合性。

3 結論

本實驗以垂盆草為原料，打磨成粉，溶劑浸提。由于黃酮類化合物的結構特征，采用乙醇為溶劑進行提。由實驗結果可知，在提取溫度為30℃-50℃范圍內，溫度升高可以加快提取總黃酮的速率，但溫度超過50℃時，苷鍵水解和細胞內色素的溶出會影響總黃酮的提取速率。適合的料液比可以有效地溶解總黃酮，而且不會造成浪費。本實驗采用響應面法優化提取總黃酮的反應條件，優化結果與試驗較接近，說明應用響應面法優化提取垂盆草中總黃酮的方法是可靠的。

通過響應面分析，得到用乙醇為溶劑提取垂盆草總黃酮的最佳工藝：為垂本草與溶劑比為1：15提取時間60min，提取溫度為50℃，乙醇濃度76.8%，的條件下所提取的總黃酮含量為17.1814mg/g。與單因素提取相比較，采用響應面法可以更有效的提取總黃酮，對垂盆草的研究開發具有重要意義。

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