β—欖香烯對糖尿病性視網膜病變增殖期大鼠視網膜中VEGF表達的干預作用

帥天姣　代海燕　張召弟

[摘要]目的 觀察β-欖香烯對鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）導致增殖性糖尿病性視網膜病變大鼠視網膜中血管內皮生長因子（VEGF）水平的表達，探討其對增殖性糖尿病性視網膜病變大鼠視網膜的可能作用機制。方法 選取80只Wistar大鼠，隨機分為正常對照組（NC組）、STZ誘導成功的糖尿病模型組（DC組）、低劑量β-欖香烯給藥組（BL組）與高劑量給藥組（BH），各20只。給藥組分別在手術顯微鏡下玻璃體腔內注射不同計量的β-欖香烯、蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠視網膜組織的病理學改變，取各實驗分組中的視網膜切片，對VEGF采用免疫組織化學染色法，檢測視網膜組織中VEGF的表達。結果 HE染色結果顯示，NC組視網膜各組織結構顯現清晰的層次，DC組較NC組視網膜變薄，且結構破壞，神經節細胞數減少；BL組較DC組略有提高；BH組視網膜結構較BL組有好轉。免疫組織化學染色后，檢測的各實驗組視網膜結果顯示，DC組、NC組、BL組、BH組大鼠VEGF陽性細胞核數目分別為（125.4671±8.4561）、（10.1324±2.0334）、（75.5123±7.6507）、（21.5364±1.7861）個，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 β-欖香烯可能成為治療增殖期糖尿病性視網膜病變的新作用靶點，同時可以改善晚期糖尿病性視網膜病變的發展，延緩視網膜組織的進一步惡化。

[關鍵詞]β-欖香烯；增殖性糖尿病性視網膜病變；血管內皮生長因子；鏈脲佐菌素

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（c）-0007-04

[Abstract]Objective To observe the effect of β-elemene on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in the retina of rats with proliferative diabetic retinopathy caused by streptozocin （STZ），to investigate its possible mechanism of action on retinopathy of rats with proliferative diabetic retinopathy.Methods A total of 80 Wistar rats were selected.They were randomly divided into normal control group （NC group），STZ-induced diabetes model group （DC group），low-dose β-elemene group （BL group） and high-dose group （BH group），20 rats in each group.In the administration group，different doses of β-elemene and hematoxylin-eosin staining were injected into the vitreous cavity under the surgical microscope respectively.The pathological changes of rat retina tissues were observed.Retinal slices from each experiment group were collected.Immunohistochemical staining was applied to VEGF，and the expression of VEGF in retinal tissues was detected.Results The results of HE staining showed that the tissue structure of the retina in the NC group showed a clear level.The retina was thinner in DC group than that in the NC group，and the structure was broken.The number of ganglion cells was reduced；the BL group had a slight increase compared with the DC group.The retinal structure in the BH group was better than that in the BL group.After immunohistochemical staining，the retinal results in each experimental group showed that the number of VEGF-positive nuclei in the DC group，NC group，BL group and BH group was （125.4671±8.4561），（10.1324±2.0334），（75.5123±7.6507），（21.5364±1.7861） respectively，differences between the groups were statistically significant （P<0.05）.Conclusion β-elemene may become a new target for the treatment of proliferative diabetic retinopathy.At the same time，it can improve the development of advanced DR and delay the further deterioration of retinal tissue.

[Key words]β-elemene；Proliferative diabetic retinopathy；Vascular endothelial growth factor；Streptozotocin

我國糖尿病患病率日益增加，糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是眼部的一種嚴重并發癥[1]，可導致不可逆性的失明。β-欖香烯目前已在糖尿病腎病中被廣泛研究并應用，但其對DR增殖期的影響國內外罕有研究涉及于此，且其對DR大鼠血管內皮生長因子（VEGF）的干預作用，研究者也罕有報道[2]。本研究主要通過觀察β-欖香烯對鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）致DR大鼠增殖期視網膜中VEGF的干預影響，應用免疫組織化學染色檢測VEGF的表達，從而進一步研究β-欖香烯對DR的整個疾病過程的進展和機制，以便日后在臨床治療中提供更科學的依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

選取80只清潔級Wistar大鼠，雌雄各一半，2個月齡，體重為160～200 g，由牡丹江醫學院實驗動物中心所提供。

1.2主要實驗試劑

β-欖香烯（沈陽萬愛普醫藥有限公司）；STZ（美國 Sigma公司）；VEGF一抗（武漢博士德生物有限公司）；血糖儀及血糖試紙（德國羅氏公司）。

1.3 DR大鼠的模型建立以及實驗具體分組

選取實驗級Wistar大鼠80只，隨機分為正常對照組（NC組）、糖尿病大鼠模型組（DC組）、低劑量實驗組（BL組）、高劑量實驗組（BH），每組均為20只。適應性喂養1周后，DR組、BL組和BH組在進食8 h后，一次性腹腔注射STZ（溶于新鮮配制的0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液，pH 4.5）60 mg/kg，NC組以等量的枸櫞酸緩沖液，同樣一次性進行腹腔注射。注射后的72 h，采大鼠的鼠尾靜脈血液，來獲取其空腹的血糖數值，空腹血糖數值≥16.7 mmol/L，糖尿病性大鼠的模型就視為建立成功。自糖尿病模型建成后，每天固定時間段內，用高脂高糖飲食飼養DC組、BL組及BH組大鼠，NC組給予含0.02 ml/ml DMSO的生理鹽水灌胃，持續進行16周。16周末次給藥后BL組及BH組大鼠進行腹腔注射100 g/L水合氯醛0.01～0.02 ml，用以麻醉。所有實驗大鼠腹腔麻醉后，雙眼均用復方托品卡胺滴眼液散瞳，之后玻璃體腔內分別注射1、3 μl計量的β-欖香烯，繼續飼養2周。

1.4取材處理

腹腔藥物注射14 d后，將所有實驗大鼠處死[3]，采用石蠟將其組織包埋，而后對所有大鼠的視網膜的石蠟模型進行切片[4]，用來行免疫組織化學染色和組織病理學染色，之后利用光學顯微鏡對各組織病理學的變化進行觀察，同時觀察視網膜中VEGF蛋白的表達程度[5]。

1.5指標測定

大鼠實驗模型眼球浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中24 h，制成厚度為4 μm的視網膜組織切片，并用蘇木精-伊紅染色后，取光學顯微鏡對每組大鼠的視網膜組織形態變化進行觀察。依照DAB和SP顯色試劑盒操作方法，對組織切片進行免疫組織化學染色及DAB顯色，再進行復染。最終，應用光學顯微鏡觀察VEGF蛋白的表達情況[6]。在觀察的顯微鏡下，如在視網膜細胞核內出現黃色或棕黃色顆粒者，則計為陽性細胞。對于每張視網膜組織的石蠟切片，在陽性表達區域內，再隨機選擇5個無重疊的高倍視野區來平均計數視網膜中陽性細胞核數。

1.6統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1組織病理學檢測

HE染色結果顯示，NC組大鼠的視網膜細胞排列緊密且規則，各層組織結果清晰分明（圖1）；DC組大鼠的視網膜與NC組大鼠視網膜相比較薄，且神經節細胞排列呈現不規則趨勢并發生水腫，內界膜還可看到有不同程度的斷裂情況（圖2）；BL組與DC組相比略有改善（圖3）；BH組的視網膜各組織結構基本正常，與DC組相比明顯改善（圖4）。

2.2免疫組織化學染色

NC組大鼠只在視網膜神經節細胞層的細胞核內可見到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽性細胞核數為（10.1324±2.0334）個（圖5）；DC組大鼠視網膜神經節外核層、內核層及細胞層細胞核內均可見到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽性細胞核數為（125.4671±8.4561）個，與NC組相比較明顯增加（圖6）；BL組大鼠視網膜神經節內核層、細胞層細胞核內可觀察到棕黃色或黃色顆粒，VEGF蛋白陽性細胞核數為（75.5123±7.6507）個，較DC組有所改善（圖7）；BH組大鼠VEGF蛋白內核層可見極少量的棕黃色或黃色顆粒，其主要在視網膜神經節細胞層內進行表達，VEGF蛋白陽性細胞核數為（21.5364±1.7861）個，與DC組、BL組相比明顯減少；各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）（圖8）。

3討論

DR是糖尿病并發癥的常見疾病之一，也是眼部最為常見、最為嚴重的微血管疾病之一[7]。DR先是視網膜毛細血管周細胞的死亡，逐步發展為視網膜形成大片新生血管，最終牽拉導致視網膜脫離，視力喪失[8]。目前，多數研究者認為，視網膜細胞在高糖及缺氧的環境中進行過度、過多的氧化應激反應，會導致視網膜周細胞以及內皮細胞嚴重受損[8]。其中，凋亡又是DR發生、發展的關鍵因素[9]。視網膜組織的缺血、缺氧狀態又同時導致視網膜基底膜增厚，毛細血管的管腔又因內皮細胞的水腫而變窄，甚至最終導致血管閉塞，而使血-視網膜屏障遭到破壞[10]。糖尿病病程越長，血-視網膜屏障破壞越嚴重[11]，視網膜缺血、缺氧的范圍就越廣泛。視網膜新生血管向玻璃體內不停地破裂延伸，使得玻璃體積血，隨著病程的發展，最后引起牽引性的視網膜脫離[12]。

β-欖香烯為我國擁有自主知識產權的中藥單體[13]，具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化、保護心血管及降血脂等重要藥理作用，目前已被應用于糖尿病腎病的治療中，但其對DR增殖期的影響國內罕有研究涉及于此[3]。

VEGF是針對血管內皮細胞有較高特異性的促有絲分裂原[14]，在促進內皮細胞和視網膜色素上皮細胞增殖方面起到關鍵作用，同時又可以增加血管的通透性。當視網膜組織處于高糖環境或缺氧環境下，視網膜VEGF的含量升高，使其表達過度[15]，從而引起視網膜毛細血管閉塞，形成無灌注[16]，最終導致視網膜毛細血管的內皮細胞大量凋亡，造成視網膜局部缺血，導致血-視網膜屏障損傷。β-欖香烯可以通過抑制VEGF引起的新生血管[17]達到抑制DR發展的作用。

綜上所述，β-欖香烯可能成為治療增殖期DR的新作用靶點，同時可以改善晚期DR的發展，延緩視網膜組織的進一步病變，對于治療增殖期DR的藥物選擇提供了一個新的思路。

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（收稿日期：2018-03-05 本文編輯：祁海文）