新疆維吾爾族及哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性與腫瘤壞死因子-α-308基因多態性的相關性研究

高 云 謝小兵

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，是一種嚴重危害人類健康的常見的以持續性氣流受限為特征的呼吸系統疾病之一，具有較高的致殘率和致死率。隨著環境污染日益加重，人口老齡化的加速和吸煙人數的增多，COPD的發病率和病死率正逐年增高。目前認為COPD的發生發展可能與環境因素、遺傳因素和個體易感因素相關，且發病機制在不同的基因和不同的環境因素及不同種族人群的COPD患者中不同[1-2]，流行病學調查發現COPD具有家族聚集傾向和種族地域差異性[3]。有關其發病的確切機制目前尚未完全明了，公認的機制包括炎癥反應機制、氧化/抗氧化失衡，蛋白酶/抗蛋白酶失衡機制等，其中炎癥過程是目前公認的主要致病機制[4]。

近年來有研究發現腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)在COPD患者的痰液及血液中均能檢測出其水平增高[5]，是導致COPD、肺實質受損及慢性炎癥損傷的細胞因子在COPD的發病過程中起著重要作用[6]。TNF-α的基因序列分析顯示，在啟動子-308位點存在多態性，該位點多態性對TNF基因的轉錄和表達有一定的影響[7]。目前對COPD與TNF-α-308基因多態性的相關性研究結論不一，有研究發現[8-9],TNF-α-308與亞洲患COPD的人群存在相關性，但與高加索地區患COPD的人群無相關性。這些研究提示COPD的易感性與TNF-α-308基因的多態性在不同人群中的作用機制可能不同。因此，本研究通過分析新疆維吾爾族、哈薩克族COPD組與對照組TNF-α-308位點基因型的分布特點，來探討該基因的多態性與新疆維吾爾族、哈薩克族人群COPD易感性的關系。

資料與方法

1.研究對象 選擇2014年1月至2016年1月,在我院老年醫學中心一病區住院治療的維吾爾族及哈薩克族COPD患者各80例為病例組，診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》的標準[10]，同時選擇于我院體檢的維吾爾族及哈薩克族健康體檢者各80例為對照組,其中維吾爾族健康對照組中男性48例；女性32例，哈薩克族男性51例，女性29例；平均年齡分別為(55.2±6.7)歲、(54.3±8.1)歲。病例組：維吾爾族COPD患者平均年齡(52.3±6.4)歲；男性43例，女性37例；哈薩克族COPD患者平均年齡(53.7±5.8)歲；男性39例，女性41例。以上四組在年齡、性別，BMI及吸煙指數等一般資料的比較,均差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，且入選對象均為無血緣關系的人群。所有入選患者及健康志愿者均知情同意，并簽署知情同意書。

(1)納入標準 病例組：診斷均符合中華醫學會呼吸病學會2013年制定的《慢性阻塞性肺病診治指南》修訂版[10]中COPD的診斷標準：即規定吸入支氣管擴張劑后第一秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，且FEV1小于預計值的80%，FEV1預計值增加≤12%，同時伴有COPD的臨床癥狀如氣促、氣喘、慢性氣道阻塞。對照組：均符合以下條件：胸X線片或胸部CT正常；且肺功能符合以下指標：FEV1/FVC>70%，且FEV1大于預計值的80%。病例組及對照組各研究對象均為長期居住在新疆地區且無血緣關系及無無異族通婚史的人群。

(2)排除標準 ①合并有嚴重支氣管哮喘、支氣管擴張疾病及其他部位感染等全身炎癥反應性疾病；②合并有嚴重的糖尿病、心、肝、腎、血管疾病；③合并有肺間質纖維化、肺結核、肺癌等其他影響肺功能的疾病；④腫瘤、神經系統疾病以及自身免疫性疾病；⑤精神病患者；⑥近期使用免疫抑制劑、糖皮質激素、非甾體類抗炎藥物者；⑦近期外科手術史。

2.標本的采集與保存 對所有參與此次研究的病例組及健康對照組成員在清晨空腹使用真空負壓EDTA-K2抗凝管采集肘靜脈血標本5mL，將抗凝管上下輕輕顛倒使血液與抗凝劑充分混勻，標寫編號，-20℃低溫冰箱保存備用，待取DNA。

3.主要試劑 人外周血基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物有限公司)；DNA Marker(北京百泰克生物技術有限公司)；瓊脂糖(西班牙Sigma公司)；5×TBE電泳緩沖液(上海生工生物工程有限公司)；2×TapPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)；DNA快速純化/回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；限制性內切酶Ear1(北京天根生化科技有限公司)；無水乙醇(西安浦化學試劑有限公司)，6×Loading Buffer緩沖液(北京百泰克生物技術有限公司)。

圖1 TNF-α-308位點酶切結果 A：AA 基因型：134bp；B：GA基因型：134bp、87bp、 20bp；C：GG 基因型：87bp和20bp,注：M：Marker帶

圖2 TNF-α-308位點測序結果 A：野生型純合子GG型；B：突變 型雜合子GA型；C：突變型純合子AA型

4.主要儀器 低溫高速離心機(Heraeus公司，德國)，1000型PCR擴增儀和GelDoc2000凝膠成像儀(Bio-Rad公司，美國)，FR-250型電泳儀(上海復日科技有限公司)，KDB-80型水浴箱(重慶實驗設備有限公司)，Eppendorf移液器(德國)。

5. 引物的設計與合成 參照Sakao S[11]等設計的TNF-α-308位點的引物，引物由大連寶生物工程有限公司合成。上游引物序列為5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′，下游引物序列為5′-GAGCGT CTGCTGGCTGGGTG -3′。

6.基因組DNA提取 按照說明書應用血液基因組DNA提取試劑盒提取，將血液樣本取出，室溫下解凍，然后將全血顛倒混勻后，用移液器吸取3mL全血至無菌離心管內加入細胞裂解液，使其充分與血液混勻后10 000r/min離心5min，棄上清液重復上述步驟1～2次后向每個離心管內加入異丙醇進行充分顛倒混勻直至出現白色絮狀物(即DNA)。

7.采用PCR法檢測樣本DNA PCR總反應體系30μL，DNA模板3μL，10×Buffer 5μL，上游下游引物各3μL， Taq DNA聚合酶10μL，無菌去離子水補足至總反應體系30μL。PCR反應的擴增條件為：95℃,5min,預變性5min，共35個循環，其中95℃,變性30s，63℃,退火40s，72℃,延伸60s，末次延伸72℃,10min終止反應，4℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠對PCR產物擴增片段進行電泳檢測，在凝膠電泳成像儀下觀察樣品擴增的情況。

為進一步驗證PCR擴增產物的基因型，隨機選取純化后的三種基因型PCR擴增產物送往北京六合華大基因科技股份有限公司進行基因序列分析，。

8.統計學方法 采用SPASS17.0統計軟件進行分析。對各組間基因型和基因頻率數進行采用χ2檢驗； Hardy- Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗采用χ2檢驗；計量資料采用均數±標準差表示，各組間數據的比較采用t檢驗；采用多因素Logistic回歸分析，計算OR和95%可信區間用來檢測TNF-α-308位點基因多態性和COPD的相關性。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.TNF-α-308位點限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應基因分型 基因的PCR擴增產物被限制性內切酶處理后，經檢驗擴增良好，無非特異性擴增，擴增片段大小與實際相符，經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現TNF-α-308存在以下3種基因型：GG、GA、AA，其中GG為野生型純合子，片段長度為87bp和20bp，GA為突變型雜合子，片段長度為134bp、87bp和20bp，AA為突變型純合子，片段長度為134bp。見圖1。

2.TNF-α-308測序結果及基因型的判定 采用反向測序法進行檢測，通過對測序圖進行分析，測序結果顯示，TNF-α-308位點存在3種基因型：GG、GA和AA，測序結果見圖2。

3.哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡吻合度檢驗 根據基因測序結果，通過卡方檢驗分別統計實驗個體中TNF-α-308位點的3種基因型：GG、GA和AA，結果顯示各組TNF-α -308位點的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遺傳平衡定律(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性，可以反映兩民族人群基因的整體分布情況。

表1 兩民族間TNF-α-308位點基因型和等位基因頻率分布的比較[n(%)]

表2 兩民族間TNF-α-308位點的基因型及等位基因與COPD易感性的關系[n(%)]

4.兩個民族TNF-α-308位點的基因型和等位基因頻率分布的比較 新疆維吾爾族和哈薩克族的COPD組和對照組中，TNF-α-308位點均以GG基因型及G等位基因多見，兩組比較COPD組的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于對照組，且兩組間的基因型及等位基因頻率的分布，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

5.TNF-α-308位點的基因型及等位基因與COPD易感性的關系 通過Logistic 回歸分析，以研究對象是否患COPD為因變量，以年齡、性別、三種基因型為協變量，調整年齡、性別后進一步分析結果顯示：維吾爾族和哈薩克族COPD組AG基因型(46.3%，35%)、AA基因型(10%，6.3%)及A等位基因頻率(30%，25.6%)均高于對照組，差異有統計學意義(P=0.001，OR=0.149，95%CI=0.041～0.375；P=0.001，OR=0.158，95%CI=0.079～0.389；P=0.001，OR=0.107，95%CI=0.012～0.821；P=0.013，OR=0.357，95%CI=0.054～2.121；P=0.015，OR=0.323，95%CI=0.132～0.807；P=0.015，OR=0.343，95%CI=0.189～0.821)，提示攜帶AG和AA基因型的患者COPD發病風險增加，A等位基因可能是COPD發病的危險因素，見表2。

討 論

COPD 是一種由多個易感基因參與的復雜疾病，氣流受限不完全可逆且呈進行性的發展，受外部環境、宿主自身等因素的聯合作用在肺的不同部位，激活中性粒細胞、肺泡巨噬細胞和T 細胞等產生炎癥反應，從而加重COPD 的發生[10]，且不同的基因以及不同的環境因素，在不同COPD 患者人群中的發病機制不同[12]。研究發現其遺傳方式是每個基因只發揮一部分作用，并不是單個主基因發揮作用這不符合單基因遺傳方式，這提示COPD 的發病具有一定的遺傳性，目前已發現有多種基因與COPD 的易感性有關，并且在地域及種族方面存在著差異，因此有必要進一步了解多種遺傳因素的作用機制及其在COPD發展中的作用，為COPD的預防和診療工作提供理論依據。

COPD 是以氣道、肺血管和肺實質的慢性炎癥為其主要的病理特點，炎癥反應導致小氣道、肺泡壁及肺結締組織損傷，最終導致COPD 的發生。COPD 患者肺內被激活的炎癥細胞可釋放多種炎癥因子，包括TNF-α、白三烯、白介素等，這些炎癥因子可增強炎癥細胞的炎癥反應，從而使肺組織結構進一步破壞，因此COPD 發病中的關鍵環節是氣道炎癥[3]。TNF-α 是一個多功能的細胞因子，具有多種功能和廣泛的生物學特性，由巨噬細胞和單核細胞產生，它能夠改變平滑肌細胞的功能，從而促進氣道重構，參與調節肺部炎癥，因此被認為在慢性肺疾病發病過程中起重要作用。TNF-α影響肺功能的可能機制如下：①TNF-α可增強炎癥細胞的黏著、趨化及侵潤過程，使脂類介質、活性氧自由基及細胞因子等釋放增多，是重要的炎癥反應介質；②可能使血管內皮細胞的通透性增加，使毛細血管滲漏，使肺嚴重損傷，從而使肺功能下降；③TNF-α還能誘導黏附因子的合成與釋放，造成組織纖維增生，進而使氣道重塑肺功能受損加重。TNF-α的基因多態性與它的功能相關，基因啟動子區的多態性可能會影響其轉錄水平[13]。由于TNF-α基因啟動子區-308 位點G/A 突變能顯著影響TNF-α基因的表達水平，提示TNF -α基因-308多態性在COPD 的發病過程中起重要作用。

相關研究發現[14]，TNF-α基因的腺嘌呤(A)/鳥嘌呤(G)在-308 位點上有轉換，當脂多糖刺激時A 等位基因的雜合子個體，產生的TNF-α較GG 基因型多。Sakao等[11]用PCR 技術檢測日本群體中對照組和COPD 組的血淋巴細胞基因DNA，發現TNF-α基因型在兩者間有明顯不同，且-308位點AA 純合子和GA 雜合子基因型都使COPD 的發病風險增加。而在白種人群中的研究沒有發現兩組之間的基因型有差異[15]。國內對TNF-α-308與COPD的相關性研究發現[16-17]，TNF-α-308位點的多態性與亞洲人群COPD的發病相關，漢族人群在排除了年齡、性別、吸煙等因素對實驗的影響外，TNF-α-308等位基因與COPD患者的易感性存在相關性。而龔燕等[18]在漢族人中的研究結果顯示，該基因位點的多態性與COPD的易感性無關。王妨娥、吳水淼等[19-20]，在對新疆維吾爾族和哈薩克族TNF-α-308位點基因多態性與COPD易感性的研究中發現，TNF-α-308位點的基因型和等位基因的頻率在COPD組和對照組之間差異有統計學意義，TNF-α-A等位基因可能是COPD的危險因素。目前有關COPD 與TNF-α基因-308 多態性的相關性研究中，其分析結果在不同的種族并不一致，因此有必要繼續對其他種族 TNF-α-308位點的基因多態性與COPD的相關性做進一步的研究，以確定該位點的基因多態性在COPD 發生發展中的作用。

本研究中各組基因型的分布，根據基因測序的結果分別統計TNF-α-308位點的3種基因型：GG、GA和AA結果顯示，各組TNF-α -308位點的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遺傳平衡定律(P>0.05)，說明樣本具有群體代表性，可以反映維、哈兩民族人群基因的整體分布情況。我們通過對新疆維、哈兩民族TNF-α-308位點基因型和等位基因頻率的分布進行比較發現，兩組均以G等位基因及野生純合GG基因型多見，研究結果顯示COPD組的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于對照組，且兩組間的基因型及等位基因頻率的分布差異有統計學意義(P<0.05)，TNF-α -308位點的A等位基因可能是新疆維吾爾族和哈薩克族COPD發病的高危因素，而攜帶A等位基因及AG和AA基因型的患者發病風險相應增加，提示TNF-α-308位點基因的多態性與新疆維、哈兩民族COPD的易感性相關。本研究結果與文獻[21-22]相似，進一步說明TNF-α- 308位點基因多態性與COPD發病存在明顯的相關性。

綜上所述，TNF-α-308位點相關的基因型及等位基因頻率可以作為遺傳性標記在臨床上進行檢測，用于早期發現維吾爾族及哈薩克族COPD易感的高危人群，對于預防COPD的發展有著重要的意義，由于COPD在不同的種族及人群中的易感性，可能存在一定的差異，而且COPD是一種比較復雜的多基因遺傳性疾病，因此我們需要進一步擴大樣本量在后續的研究中，為最終揭示遺傳因素如何影響COPD 發生、發展的具體作用機制的進一步深入研究提供理論依據。