用單分子技術(shù)研究Sso7d與DNA的相互作用?

滕翠娟陸越馬建兵李明陸穎 徐春華?

1)(中國(guó)科學(xué)院物理研究所,北京凝聚態(tài)物理國(guó)家研究中心,軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)2)(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)物理科學(xué)學(xué)院,北京 100049)

(2018年4月9日收到;2018年4月21日收到修改稿)

為了維持基因的穩(wěn)定性,每種生物體都含有一套獨(dú)特的染色質(zhì)蛋白來(lái)保護(hù)脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)構(gòu),觀察染色質(zhì)蛋白對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的作用過(guò)程和結(jié)果,可以幫助人們了解這些蛋白的具體功能和作用機(jī)理.硫化葉菌是一種能在高溫下存活的古細(xì)菌,Sso7d是硫化葉菌的一種染色質(zhì)蛋白.深入地了解Sso7d和DNA鏈的相互作用,有助于解釋硫化葉菌的DNA為何能在高溫環(huán)境下保持活性,本文通過(guò)原子力顯微鏡(AFM)和磁鑷兩種單分子操作手段,研究了Sso7d與DNA的相互作用.AFM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果給出了Sso7d與DNA的作用過(guò)程:結(jié)合Sso7d后,DNA首先發(fā)生彎折,然后出現(xiàn)loop結(jié)構(gòu),最終DNA會(huì)團(tuán)聚為致密的核結(jié)構(gòu).利用磁鑷裝置測(cè)量了Sso7d的結(jié)合對(duì)打開(kāi)DNA雙鏈的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Sso7d的結(jié)合導(dǎo)致打開(kāi)DNA雙鏈的力的增大,經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析,計(jì)算出Sso7d與DNA結(jié)合的結(jié)合能?G=3.1kBT,平均每5.5個(gè)堿基對(duì)(bp)結(jié)合一個(gè)Sso7d,較高的結(jié)合密度和較大的結(jié)合能,兩方面的作用結(jié)果,解釋了Sso7d能夠穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的原因.

1 引 言

在生物體內(nèi),脫氧核糖核酸(DNA)的解旋、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等一切活動(dòng)都是在各種相關(guān)蛋白質(zhì)的調(diào)控下進(jìn)行的.其中染色質(zhì)蛋白在一切生物體內(nèi)都是必不可少的,其在基因的結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用,尤其是能夠有效地折疊DNA,保證基因結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[1].根據(jù)16S核糖體核糖核酸(RNA)的不同,將生物分為三個(gè)域[2],分別為細(xì)菌(bacteria)、真核生物(eukarya)和古細(xì)菌(archaea).在真核生物中,DNA在組蛋白(histone)的作用下纏繞成DNA的基本結(jié)構(gòu)單元——核小體[3].在原核生物體內(nèi),存在很多DNA結(jié)合蛋白,如HU,IHF,H-NS,Fis和Lrp等[4,5],在這些蛋白的作用下,染色質(zhì)DNA被折疊加工為一個(gè)致密的結(jié)構(gòu),稱(chēng)之為擬核.在古細(xì)菌中,染色質(zhì)蛋白的情況也是相當(dāng)復(fù)雜的[6].古細(xì)菌兩個(gè)最大的門(mén):廣古菌(Euryarchaeota)和泉古菌(Crenarchaeota),其中的廣古菌,存在類(lèi)似histone的染色質(zhì)蛋白[7,8];而泉古菌中,沒(méi)有這種染色質(zhì)蛋白,取而代之的是一系列分子量比較小的染色質(zhì)蛋白,如Alba,Sul7d,CC1和Cren7等[9,10].其中的Sul7d存在于硫化葉菌目(Sulfolobales)中,是一系列分子量為7 kDa的染色質(zhì)蛋白,本文研究的是其中的Sso7d.

在硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)中,Sso7d是一種大量存在的染色質(zhì)蛋白,其占細(xì)胞中蛋白質(zhì)總量的5%[11],近年來(lái)對(duì)Sso7d的研究已逐步深入.Sso7d由63個(gè)氨基酸組成[12],分子量為7 kDa[13].在溶液中,Sso7d以單體形式結(jié)合在雙鏈DNA(dsDNA)上[12,14],每個(gè)Sso7d分子可以結(jié)合4—6個(gè)堿基對(duì)[15].Sso7d的結(jié)合可以增加DNA的負(fù)超螺旋[16,17],并且能夠使DNA的熔解溫度提高30.6?C[18],其人工突變體能夠承受更高的熔解溫度和pH值范圍[19].Sso7d現(xiàn)在經(jīng)常作為拼接蛋白連接DNA和其他有機(jī)分子[20],還可以作為支架蛋白把多個(gè)蛋白連接為一個(gè)功能性的復(fù)合體,并促進(jìn)其互相作用[19,21].更加深入地掌握Sso7d和DNA的作用機(jī)理,可以更好地發(fā)揮Sso7d在這些系統(tǒng)構(gòu)建中的功能.Sso7d與小片段DNA(8 bp,bp為堿基對(duì))結(jié)合后的復(fù)合物的晶體衍射結(jié)果顯示,Sso7d結(jié)合在DNA小溝上,通過(guò)嵌入DNA雙螺旋使DNA產(chǎn)生60?的彎折[22,23].目前,對(duì)于較長(zhǎng)片段的DNA與Sso7d的結(jié)合狀態(tài),有電子顯微鏡和原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)的結(jié)果[12,24],但并沒(méi)有直觀地給出Sso7d與DNA的作用過(guò)程.本文采用AFM研究Sso7d的結(jié)合對(duì)DNA形態(tài)的影響,觀察不同濃度Sso7d條件下較長(zhǎng)片段DNA與Sso7d結(jié)合后的結(jié)構(gòu)圖像,分析得出DNA的團(tuán)聚過(guò)程;用單分子磁鑷研究Sso7d的結(jié)合對(duì)打開(kāi)DNA雙鏈的影響,測(cè)定了不同Sso7d濃度下打開(kāi)DNA雙鏈的力的大小,計(jì)算得到了Sso7d和DNA結(jié)合的結(jié)合能.

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 蛋白質(zhì)及反應(yīng)溶液

染色質(zhì)蛋白Sso7d,由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的黃力研究員提供,制備方法參考文獻(xiàn)[25,26].Sso7d溶于保存溶液中,具體成分為10 mmol/L Hepes(pH值7.6,25?C),0.2% 牛血清白蛋白(BSA),0.1%Tween-20,25 mmol/L NaCl,?20?C冰箱保存.磁鑷實(shí)驗(yàn)中,反應(yīng)溶液和Sso7d的保存溶液相同.AFM實(shí)驗(yàn)中,為避免BSA對(duì)成像的影響,在制作樣品過(guò)程中所用的DNA與Sso7d反應(yīng)的溶液中不含有BSA.

2.2 DNA的制備

實(shí)驗(yàn)中使用了三種不同的DNA以實(shí)現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?一是總長(zhǎng)度為3000 bp的直鏈DNA(DNA1);二是含有1200 bp的直鏈DNA(DNA2);三是含有發(fā)卡(hairpin)結(jié)構(gòu)的總長(zhǎng)度為3000 bp的DNA(DNA3).DNA1和DNA2直接由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制得.DNA3的制備可參考文獻(xiàn)[27],DNA3含有一個(gè)hairpin結(jié)構(gòu)和兩個(gè)dsDNA手柄.其中,hairpin結(jié)構(gòu)含有120 bp,兩個(gè)手柄DNA長(zhǎng)度分別為2300和700 bp.

2.3 DNA-Sso7d結(jié)合物的制備

在反應(yīng)溶液(10 mmol/L Hepes,pH值 7.6,25 mmol/L NaCl)中,終濃度為0.5 nmol/L的DNA1分別與終濃度為0.5,1.0,3.0μmol/L的染色質(zhì)蛋白Sso7d混合均勻,室溫下反應(yīng)5 min,分別得到DNA:Sso7d質(zhì)量比為18:7,9:7,3:7的DNA1-Sso7d反應(yīng)產(chǎn)物;之后,加入與各產(chǎn)物溶液等體積的戊二醛固定液(10 mmol/L Hepes,pH值7.6,25 mmol/L NaCl,0.8%戊二醛),固定20 min;最后,用AFM制片溶液(10 mmol/L Tris-HCl,pH值 7.4,10 mmol/L MgCl2)稀釋上述所得各溶液到合適的濃度,以備滴至云母片制作樣品.DNA2-Sso7d復(fù)合物的制備方法同上.

2.4 AFM及其樣品的制備

實(shí)驗(yàn)所用的AFM是Bruker公司的高分辨AFM Multimode 8.掃描模式為scanasyst,掃描探針型號(hào)為scanasyst-air,掃描速率為0.977 Hz.待掃描樣品的準(zhǔn)備過(guò)程為:取12μL待測(cè)已稀釋到合適濃度的DNA與Sso7d的反應(yīng)溶液,滴到干凈的云母片(1 cm×1 cm)上,孵育5 min;之后用4 mL的超純水沖洗云母片以去除鹽離子和未吸附到云母片上的DNA-Sso7d復(fù)合物;最后,用氮?dú)饩徛蹈稍颇副砻?

2.5 磁 鑷

實(shí)驗(yàn)所用磁鑷為實(shí)驗(yàn)室搭建的縱向磁鑷裝置,采樣頻率為20 Hz.實(shí)驗(yàn)中所用DNA為DNA3.首先,DNA和順磁性小球(Invitrogen,Dynabeads M-280,表面Streptavidin修飾)按1:10的摩爾比混合,室溫緩慢旋轉(zhuǎn)混勻5 min;然后,向反應(yīng)體系中加入磷酸緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,注入磁鑷樣品槽,孵育5 min;最后,通過(guò)向樣品槽中緩慢加入磷酸緩沖液,沖去游離的順磁性小球和未連接的DNA,即完成目標(biāo)單分子連接的構(gòu)建.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 Sso7d結(jié)合導(dǎo)致的DNA鏈凝聚的作用過(guò)程

DNA1分別與不同濃度的Sso7d溶液反應(yīng)5 min后,用戊二醛固定液固定20 min,然后用AFM 制片溶液稀釋,得到終溶液,分別滴到云母片上制得待掃描樣品.從AFM圖像上可以看出,反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為5 min時(shí),當(dāng)Sso7d:DNA的質(zhì)量比(7:18)比較低時(shí),如圖1(a)所示,DNA上出現(xiàn)很多彎折點(diǎn),彎折點(diǎn)處結(jié)合了Sso7d.隨著Sso7d:DNA質(zhì)量比(7:9)的提高,DNA在Sso7d的作用下,凝聚出一個(gè)比較緊密的小核,如圖1(b)所示.當(dāng)Sso7d:DNA質(zhì)量比(7:3)進(jìn)一步提高,如圖1(c),整條DNA凝聚為致密的核結(jié)構(gòu),此反應(yīng)條件下,剩余的自由游離的DNA鏈變得很少.

為了進(jìn)一步研究Sso7d與DNA的結(jié)合狀態(tài)是否隨時(shí)間發(fā)生變化,本文做了另一組對(duì)照實(shí)驗(yàn):其他反應(yīng)條件同上,只改變反應(yīng)時(shí)間,將Sso7d和DNA1的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為60 min.圖1(d)顯示Sso7d:DNA的質(zhì)量比為7:18時(shí),反應(yīng)60 min后,DNA1-Sso7d復(fù)合物的構(gòu)象圖,從圖中可以看出DNA出現(xiàn)loop結(jié)構(gòu).當(dāng)Sso7d:DNA的質(zhì)量比為7:9時(shí),反應(yīng)60 min后,DNA1-Sso7d復(fù)合物的構(gòu)象圖如圖1(e)所示,可以看到更多的loop結(jié)構(gòu),而且DNA進(jìn)一步團(tuán)結(jié)在小的凝聚核周?chē)?當(dāng)Sso7d與DNA的質(zhì)量比達(dá)到7:3時(shí),反應(yīng)60 min后,如圖1(f)所示,DNA完全凝聚為致密的核結(jié)構(gòu),無(wú)游離的自由DNA鏈.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,整體而言,在Sso7d:DNA質(zhì)量比相同的條件下,和5 min反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果相比,反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)之后,在染色質(zhì)蛋白Sso7d的作用下,DNA變得更加致密.

綜合以上結(jié)果,可以看出,DNA的凝聚成核過(guò)程始于Sso7d的作用導(dǎo)致的DNA的彎折,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),loop出現(xiàn);之后DNA在Sso7d的作用下凝聚出一個(gè)致密的小核,其余游離的DNA鏈分布在小核周?chē)?直至整條DNA凝結(jié)為較為致密的核結(jié)構(gòu).而且,高濃度的Sso7d才能夠使DNA高度凝聚,這說(shuō)明硫化葉菌中Sso7d的含量很高[11]是很有必要的.

Loop結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)是DNA的凝聚過(guò)程中十分重要的環(huán)節(jié).由于DNA1-Sso7d復(fù)合物的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,若DNA太長(zhǎng)則不易看清細(xì)節(jié).因此,本文選用一條較短的DNA鏈(DNA2,1200 bp)做了Sso7d與DNA相結(jié)合的實(shí)驗(yàn),其AFM圖像如圖2所示,更加清楚地展示了DNA loop的形成過(guò)程.實(shí)驗(yàn)中,Sso7d和DNA的質(zhì)量比為7:18,反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為5 min和60 min.反應(yīng)5 min后,DNA構(gòu)象如圖2(b)和圖2(c)所示,DNA鏈出現(xiàn)不同程度的彎折;反應(yīng)60 min后,DNA構(gòu)象如圖2(d)所示,彎折更加明顯,并出現(xiàn)loop結(jié)構(gòu).整個(gè)反應(yīng)過(guò)程解釋為:Sso7d結(jié)合在DNA上,使DNA發(fā)生彎折;又由于DNA帶負(fù)電,Sso7d帶正電,Sso7d的結(jié)合中和了DNA的部分電荷,DNA的靜電排斥變?nèi)?DNA變得更容易彎曲;彎曲的DNA鏈相互靠近,結(jié)合在DNA上的Sso7d之間可能發(fā)生相互作用導(dǎo)致了loop結(jié)構(gòu)的出現(xiàn),從而促進(jìn)DNA的進(jìn)一步凝聚.

圖1 3000 bp DNA1與不同濃度的Sso7d溶液作用后的構(gòu)象圖 (a)0.5μmol/L Sso7d,5 min;(b)1μmol/L Sso7d,5 min;(c)3 μmol/L Sso7d,5 min;(d)0.5 μmol/L Sso7d,60 min;(e)1 μmol/L Sso7d,60 min;(f)3μmol/L Sso7d,60 minFig.1.Conformations of 3000 bp DNA1 reacted with Different Sso7d concentration:(a)0.5μmol/L Sso7d,5 min;(b)1μmol/L Sso7d,5 min;(c)3μmol/L Sso7d,5 min;(d)0.5μmol/L Sso7d,60 min;(e)1μmol/L Sso7d,60 min;(f)3μmol/L Sso7d,60 min.

圖2 1200 bp的DNA2及其與0.5μmol/L的Sso7d溶液作用不同時(shí)間后的構(gòu)象圖 (a)1200 bp DNA2;(b),(c)5 min;(d)60 minFig.2.Conformations of 1200 bp DNA2 with 0.5μmol/L Sso7d reacted at Different time:(a)1200 bp DNA2;(b),(c)5 min;(d)60 min.

3.2 Sso7d使DNA彎折的角度測(cè)量

在圖1(a)和圖2(b)中,DNA被Sso7d結(jié)合后發(fā)生彎折,關(guān)于Sso7d引起的DNA的彎折角度的大小,有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道.有核磁共振實(shí)驗(yàn)得到了Sso7d引起的DNA彎折角度為30?[28],但是在核磁共振實(shí)驗(yàn)中,溶液環(huán)境下DNA在結(jié)合態(tài)和自由態(tài)之間的切換很容易導(dǎo)致彎折角度測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)偏差;另外有文獻(xiàn)得到了由Sso7d與DNA相互作用后的結(jié)晶結(jié)構(gòu),測(cè)得Sso7d使DNA彎折60?[22,23],仍有研究對(duì)此表示質(zhì)疑,其認(rèn)為在晶體衍射實(shí)驗(yàn)中,Sso7d-DNA復(fù)合物只能被固定為一種趨向于形成晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)象,并不能反映其在溶液中的真實(shí)狀態(tài)[24].在AFM實(shí)驗(yàn)中,Sso7d和DNA在液體環(huán)境中相互作用,之后其復(fù)合物構(gòu)象被戊二醛固定,因此通過(guò)AFM圖像能夠準(zhǔn)確地反映其在液體環(huán)境中的狀態(tài),更加真實(shí)地反映其生理狀態(tài).本文對(duì)AFM結(jié)果中的DNA的彎折角度Φ進(jìn)行了測(cè)量統(tǒng)計(jì),如圖3所示,通過(guò)高斯擬合,得到彎折角度值為58.5?.

圖3 DNA彎折角度測(cè)量 (a)DNA彎折角度測(cè)量示意圖;(b)彎折角度統(tǒng)計(jì)分布圖和高斯擬合曲線Fig.3.Measurement of the DNA kink angle induced:(a)Schematic diagram of DNA kink angle measurement;(b)histogram of the counts of kink angle and Gaussian fitting curve.

3.3 Sso7d的結(jié)合對(duì)打開(kāi)DNA雙鏈的影響

硫化葉菌中的Sso7d含量極高,占其細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)總重量的5%[11],如此高濃度的Sso7d,足以將DNA團(tuán)聚為如圖1(f)所示的緊致結(jié)構(gòu),使DNA變得相當(dāng)穩(wěn)定.有DNA熱熔解實(shí)驗(yàn)顯示,在DNA溶液中加入一定量的Sso7d,可以使DNA的熔解溫度提高30.6?C[18].可見(jiàn),染色質(zhì)蛋白Sso7d可以提高dsDNA的熱穩(wěn)定性.因此,本文預(yù)測(cè)結(jié)合染色質(zhì)蛋白Sso7d后,會(huì)提高DNA雙鏈的結(jié)合能,此結(jié)合能的提高可以直觀地表現(xiàn)為打開(kāi)DNA雙鏈所需要的力的變化.而打開(kāi)DNA雙鏈的力可以通過(guò)設(shè)計(jì)磁鑷實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量.

本文所用磁鑷裝置示意圖如圖4(a)所示,所用DNA底物是DNA3,其含有一段120 bp的hairpin結(jié)構(gòu).圖4(b)舉例說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所施加磁力的變化過(guò)程以及DNA的拉伸曲線.

對(duì)于所用的120 bp hairpin DNA,在本文實(shí)驗(yàn)條件下,不含有染色質(zhì)蛋白的情況下,當(dāng)施加在磁性小球上的拉力增大到約14 pN時(shí),hairpin被完全打開(kāi).隨著加入Sso7d濃度的提高,打開(kāi)hairpin所需要的拉力逐漸增大.如圖4(c)所示,當(dāng)Sso7d濃度達(dá)到1μmol/L時(shí),打開(kāi)hairpin的力的大小為19 pN時(shí),之后再提高Sso7d的濃度,打開(kāi)hairpin的力不再變化.

實(shí)驗(yàn)測(cè)量了hairpin被打開(kāi)成為單鏈的長(zhǎng)度,此長(zhǎng)度隨Sso7d濃度的變化而發(fā)生變化,如圖4(d)所示.當(dāng)Sso7d的濃度從0開(kāi)始逐漸增大時(shí),hairpin的打開(kāi)長(zhǎng)度逐漸增大,其原因是隨著Sso7d濃度的增大,打開(kāi)hairpin的力在增大,堿基之間的距離隨力的增大而增大,從而導(dǎo)致整個(gè)hairpin打開(kāi)成單鏈后的長(zhǎng)度增大.但是,當(dāng)Sso7d的濃度進(jìn)一步增大時(shí),hairpin打開(kāi)后的長(zhǎng)度反而縮小,此時(shí)可能是因?yàn)閔airpin變?yōu)閱捂満笕杂蠸so7d結(jié)合在上邊導(dǎo)致其長(zhǎng)度縮短.

結(jié)合能是表征結(jié)合強(qiáng)度的物理參量,平衡常數(shù)能表征化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行的最大程度,對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的120 bp的hairpin在不同濃度的Sso7d的條件下打開(kāi)hairpin的力進(jìn)行分析,可以得到Sso7d與DNA反應(yīng)的結(jié)合能和平衡常數(shù)兩個(gè)表征量.

Sso7d以單體的形式結(jié)合在DNA上,尚未發(fā)現(xiàn)Sso7d的結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng),因此假設(shè)每個(gè)Sso7d的結(jié)合之間不存在協(xié)同作用,將Sso7d與DNA的逐個(gè)結(jié)合反應(yīng)表示為

圖4 Sso7d對(duì)打開(kāi)dsDNA的影響 (a)實(shí)驗(yàn)示意圖;(b)hairpin被打開(kāi)的實(shí)驗(yàn)曲線;(c)打開(kāi)hairpin的力隨Sso7d濃度的變化;(d)不同濃度Sso7d條件下,hairpin被打開(kāi)為單鏈的長(zhǎng)度Fig.4.Influence of Sso7d on dsDNA:(a)Schematic diagram of the experiment;(b)example curves of hairpin unfolding;(c)variation of hairpin unfolding force with Sso7d concentrations;(d)length of unfolded hairpin DNA at Different Sso7d concentrations.

Sso7d與hairpin的反應(yīng)體系達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí),正逆反應(yīng)速率相等,反應(yīng)的每個(gè)組分所占的比例不變,形成動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程.從DNA與不同濃度Sso7d結(jié)合后的電泳實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[16,29]以及本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都可以看出,對(duì)于不同的Sso7d濃度,hairpin上結(jié)合的Sso7d數(shù)量是不一樣的,這個(gè)現(xiàn)象可以用達(dá)到平衡時(shí)各DNA-Sso7d復(fù)合物之間的濃度比例來(lái)描述.對(duì)于反應(yīng)方程式(1)存在如下關(guān)系:

[DNA·(Sso7d)n?1]和[DNA·(Sso7d)n]分別對(duì)應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)結(jié)合n?1個(gè)Sso7d和結(jié)合n個(gè)Sso7d的DNA-Sso7d復(fù)合物濃度.從(3)式中可以發(fā)現(xiàn)整個(gè)DNA-Sso7d復(fù)合物體系的濃度變化規(guī)律:對(duì)于某個(gè)特定的Sso7d濃度,隨著Sso7d結(jié)合個(gè)數(shù)n的增加,在某個(gè)n值,也就是對(duì)應(yīng)著某種特定的DNA-Sso7d復(fù)合物時(shí),其平衡濃度所占的比例最大,在實(shí)驗(yàn)中就表現(xiàn)出結(jié)合了相應(yīng)的蛋白數(shù)量.這就是為什么在不同Sso7d濃度下,可以在hairpin上觀察到不同的Sso7d結(jié)合數(shù)量的原因.

對(duì)于結(jié)合第N個(gè)Sso7d(飽和)的狀況,存在如下關(guān)系:

隨著Sso7d濃度的增大,結(jié)合在hairpin上的Sso7d數(shù)量增多,當(dāng)Sso7d濃度大于某一臨界值時(shí),結(jié)合在DNA上的Sso7d的數(shù)量達(dá)到飽和,此時(shí)

從打開(kāi)hairpin的力隨Sso7d濃度的變化的實(shí)驗(yàn)曲線圖4(c)可以看出,當(dāng)Sso7d濃度高于1μmol/L時(shí),打開(kāi)hairpin的力幾乎不再增大.這也就是說(shuō),當(dāng)Sso7d濃度為1μmol/L時(shí),Sso7d的結(jié)合基本達(dá)到飽和,因此,(5)式成立時(shí)[Sso7d]=1μmol/L.

由于Sso7d的結(jié)合導(dǎo)致打開(kāi)hairpin的力變大,Sso7d與DNA的結(jié)合能與打開(kāi)hairpin的能量的變化相等,根據(jù)貝爾公式[30],可以得到如下關(guān)系:

式中F0為未加入Sso7d時(shí)打開(kāi)hairpin的力的大小,在本文實(shí)驗(yàn)條件下為13.7 pN;F為加入Sso7d后打開(kāi)hairpin的力的大小;x(F′)表示拉力為F′時(shí)打開(kāi)hairpin所需的反應(yīng)長(zhǎng)度變化;n為結(jié)合在hairpin上的Sso7d個(gè)數(shù);?G為單個(gè)Sso7d結(jié)合的能量.

圖1(e)和圖2(d)所用DNA:Sso7d質(zhì)量比相同,對(duì)比兩圖可知,DNA越長(zhǎng),凝聚越明顯,因此推測(cè),短DNA不易凝聚.由于hairpin的長(zhǎng)度較短,故假設(shè)hairpin沒(méi)有凝聚,不考慮除單個(gè)Sso7d與hairpin結(jié)合之外的其他能量.由此可以得出特定Sso7d濃度下的結(jié)合總能量關(guān)系.

由前文分析可知,當(dāng)Sso7d濃度為1μmol/L時(shí),Sso7d的結(jié)合達(dá)到飽和,此后的hairpin打開(kāi)拉力也幾乎不變,大小為19 pN.因此可以計(jì)算出對(duì)于飽和Sso7d濃度,N·?G=68.1kBT.將這一結(jié)果與前面得到的蛋白濃度和化學(xué)反應(yīng)系數(shù)的關(guān)系(5)式聯(lián)立,根據(jù)阿倫尼烏斯關(guān)系可以得到

Keq為化學(xué)反應(yīng)的平衡常數(shù);ω0為由嘗試頻率推導(dǎo)得出的參數(shù),與化學(xué)反應(yīng)類(lèi)型有關(guān)[31?33],此處可以取值為106(mol/L)?1.利用實(shí)驗(yàn)所得的打開(kāi)hairpin的力的值以及結(jié)合達(dá)到飽和時(shí)Sso7d的濃度值,可以計(jì)算出一個(gè)Sso7d與hairpin的結(jié)合所產(chǎn)生的結(jié)合能?G=3.1kBT,平衡常數(shù)Keq=2.2×107(mol/L)?1,還能計(jì)算出120 bp hairpin可以結(jié)合Sso7d的個(gè)數(shù)N=22,平均每個(gè)Sso7d占據(jù)DNA5.5個(gè)堿基對(duì)的位置,這一結(jié)果與DNA-Sso7d復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析結(jié)果相一致[22],驗(yàn)證了本文的推導(dǎo)和假設(shè)是成立的.從Sso7d與hairpin的結(jié)合所產(chǎn)生的結(jié)合能可以看出,每一個(gè)Sso7d的結(jié)合能都很可觀,而生物體內(nèi)大量的Sso7d足以將DNA完全包被,每一個(gè)Sso7d與DNA的結(jié)合都會(huì)引入同等大小的結(jié)合能,這從結(jié)合能的角度解釋了Sso7d為何能夠提高DNA的熔解溫度以及硫化葉菌如何在高溫下維持其基因的穩(wěn)定.

4 結(jié) 論

1)通過(guò)對(duì)比不同反應(yīng)條件下生成的DNASso7d復(fù)合物的AFM圖像,看到DNA在Sso7d作用下逐步凝聚的過(guò)程:Sso7d和DNA的相互作用,首先表現(xiàn)為DNA的彎折,然后會(huì)產(chǎn)生loop結(jié)構(gòu),以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步高度凝聚.其中l(wèi)oop結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程也被清晰地觀測(cè)到.

2)測(cè)量了結(jié)合Sso7d后的DNA鏈的彎折角度,高斯擬合結(jié)果為58.5?,與核磁共振成像和晶體衍射成像方法相比,更加真實(shí)地反映了生理狀態(tài)下Sso7d和DNA的結(jié)合狀態(tài).

3)用磁鑷方法得到了Sso7d的結(jié)合對(duì)打開(kāi)DNA雙鏈的力的影響,數(shù)據(jù)分析得到一個(gè)Sso7d結(jié)合在DNA雙鏈上所產(chǎn)生的結(jié)合能?G=3.1kBT,解釋了Sso7d能夠提高DNA的熔解溫度的原因以及硫化葉菌如何在高溫下維持基因的穩(wěn)定.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論,解釋了Sso7d對(duì)DNA的保護(hù)機(jī)理,這給硫化葉菌生活在高溫環(huán)境下而核酸卻能夠保持穩(wěn)定提供了可能的條件.近年來(lái),Sso7d的突變體經(jīng)常以腳手架的形式出現(xiàn)在大分子系統(tǒng)中,深入地研究Sso7d與DNA的相互作用過(guò)程,為精準(zhǔn)地設(shè)計(jì)和構(gòu)建Sso7d的功能提供了理論基礎(chǔ).

感謝中國(guó)科學(xué)院微生物研究所黃力研究員提供實(shí)驗(yàn)所用蛋白Sso7d.