基于COⅠ基因的中國廣頭葉蟬亞科系統發育初探

李虎， 戴仁懷

(1. 陜西理工大學，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723000； 2.貴州大學昆蟲研究所，貴州山地農業病蟲害重點實驗室，貴陽550025)

廣頭葉蟬亞科Macropsinae隸屬于半翅目Hemiptera頭喙亞目Auchenorrhyncha角蟬總科Membracoidea葉蟬科Cicadellidae，廣泛分布于世界各地。目前全世界已報道該亞科約19屬750余種，我國記錄7屬108種。廣頭葉蟬大多取食木本植物，為重要的生態、經濟林木害蟲。目前已知的寄主主要有薔薇科Rosaceae、胡頹子科Elaeagnaceae、榆科Ulmaceae、殼斗科Fagaceae、小檗科Berberidaceae(Tishechkin，1994，1999，2002)、楊柳科Salicaceae和樺木科Betulaceae等植物(Lietal.，2012，2013，2014)；也有報道廣頭葉蟬取食桑科Moraceae植物(魏重生，蔡平，1998)。

廣頭葉蟬亞科分類系統較混亂，部分族屬級分類地位一直存在爭議。Evans(1937)最先提出廣頭葉蟬科Macropsidae概念，隨后又降為亞科(Evans，1946)，包含Macropsini和Nioniini兩族；Linnavuori(1978)將Nioniini提升為亞科Nioniinae，同時將其中的Neopsis屬提升為亞科級Neopsinae，但Hamilton(1983)仍以族級水平對待；Dietrich(2005)根據形態特征恢復Neopsinae。在屬級水平上，橫皺葉蟬屬Oncopsis和斜皺葉蟬屬Pediopsis初為Bythoscopus的亞屬，后分別被提升為屬，但包括廣頭葉蟬屬Macopsis、暗紋葉蟬屬Pediopsoides、Galboa、Stenoscopus在內早期均屬于短頭葉蟬科Bythoscopidae，后被移入廣頭葉蟬亞科(Evans，1937)。Hamilton(1980)依據外形及雄蟲外生殖器特征將古北區特有屬Macropsidius降為亞屬，但Tishetshkin(2006，2007，2014)、Yang和Zhang(2015)均以屬級水平對待；在Hamilton(1980)的分類系統中，將Parasitades、Nanopsis、Kiamoncopsis也降為亞屬，但也存在爭議。

為了進一步掌握廣頭葉蟬亞科屬種間的分子差異程度和系統發育關系，本文選擇昆蟲分子系統學研究中常用的線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)為標記基因，對中國常見的廣頭葉蟬亞科5屬22種進行COⅠ基因序列擴增，研究目標序列的序列組成和遺傳距離特征，并構建中國廣頭葉蟬亞科系統發育框架，研究結果可為整個亞科的系統發育構建及物種的快速鑒定提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取中國廣頭葉蟬亞科5屬22種和片角葉蟬亞科Idiocerinae 1種進行實驗。樣本主要來源于無水乙醇浸泡標本和針插保存的干燥標本，詳細信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1DNA提取使用ddH2O清洗樣本，去ddH2O后加入STE緩沖液(樸美花等，2002)浸泡過夜，棄去STE緩沖液，用沖洗緩沖液清洗2～3次，吸水紙吸去樣本殘余液體、晾干。然后取蟲體頭胸部研磨碎，使用血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒[tgDP304-02，天根生化科技(北京)有限公司]提取總DNA測定濃度后調整為1～2 ng·L-1保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2PCR擴增引物及反應體系使用通用引物(Folmeretal.，1994)進行COⅠ基因序列片段的PCR擴增：上游引物LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；下游引物HCO2198：5’-TAAAC-TTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。PCR反應體系參考PCR試劑盒Taq PCR Master Mix，選用30 μL反應體系，針對無水乙醇浸泡標本和針插干標本進行一定的調整，模板DNA、上下游引物(10 μM)、Mix、ddH2O分別為：1 μL、2 μL、15 μL、12 μL(無水乙醇浸泡標本)；4 μL、2 μL、15 μL、9 μL(針插干標本)。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，40～43 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃總延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物原液送北京華大基因組測序部進行常規純化雙向測序。

1.2.3DNA數據處理與分析使用SeqMan對所得序列進行拼接和編輯，使用MEGA 6.06、Clustal W進行序列比對。序列組成分析和遺傳距離的計算使用MEGA 6.06，系統發育建樹使用MrBayes 3.2和PAUP*4.0。

1.2.4遺傳距離計算遺傳距離的計算基于MEGA 6.06的K2參數模型。利用Excel的數據分析功能統計平均值(Means)和標準差(SE)，使用SPSS 22.0基于最小顯著差異法(LSD)對遺傳距離進行差異顯著性分析。

1.2.5系統發育樹構建選用最優模型GTR+I+G(參數：-lnL=5 421.611 8，K=10，AIC=10 863.223 6)，使用PAUP*4.0 [參數：Lset Base=(0.340 3，0.166 2，0.109 6)，Nst=6，Rmat=(0.883 4，6.885 8，2.787 8，0.547 6，17.361 7)，Rates=gamma，Shape=0.814 6，Pinvar=0.416 0]，最大似然(ML)法構建系統發育樹；使用MrBayes 3.2[參數：lset nst=6，rates=gamma，prset statefreqpr=fixed (0.340 3，0.166 2，0.109 6，0.383 8)，shapepr=fixed(0.8146)，pinvarpr=fixed(0.416 0)；prset revmatpr=fixed (0.883 4，6.885 8，2.787 8，0.547 6，17.361 7，1.000 0)]，貝葉斯(BI)法構建系統發育樹。

表1 廣頭葉蟬亞科系統發育分析選擇的代表種Table 1 Representative species used for phylogeny analysis of Macropsinae

2 結果

2.1 序列組成

序列拼接和比對刪除兩端參差不齊的堿基序列后為642 bp，序列組成分析結果見表2。內群數據組各成分與含外群數據組之間除簡約信息位點有所下降、自裔位點輕微上升外沒有明顯的差異。23條序列中，保守位點304個，變異位點338個，簡約信息位點289個，自裔位點49個，T、C、A、G含量分別為35.7%、17.4%、32.6%和14.3%，A+T含量為68.3%，明顯高于G+C含量(31.7%)。

表2 COⅠ基因序列數據組的序列組成統計值Table 2 Statistics of nucleotide composition of each data set for COⅠ gene sequences

2.2 遺傳距離

經統計，COⅠ基因序列片段在種間、屬間和亞科間的遺傳距離的差異具有統計學意義(表3)。

表3 COⅠ基因序列數據組不同階元間P距離的差異統計Table 3 Statistics of P-distance of each data set for COⅠ gene sequences in different taxa

注： 不同字母表示兩者之間差異有統計學意義(LSD：P<0.05)

Notes： different letters indicate there is a significant difference (LSD：P<0.05)

2.3 系統發育分析

ML樹(圖1：左)和BI樹(圖1：右)的聚類結果基本一致，僅針突尖尾葉蟬Pedionisacerosa和齒緣尖尾葉蟬P.aculeata的聚類稍有差異。最先分出廣頭葉蟬屬的4種，有較高的置信度；隨后斜皺葉蟬屬種類Pediopsissp.分出；接著南昆山尖尾葉蟬Pedionisnankunshanensis與廣頭葉蟬屬的2種聚在一起；暗紋葉蟬屬2種與尖尾葉蟬屬Pedionis4種聚成一大支；橫皺葉蟬屬4種聚在一起形成一支，并與尖尾葉蟬屬、廣頭葉蟬屬和暗紋葉蟬屬剩余種聚合在一起。

圖1 基于COⅠ基因最大似然法(左)和貝葉斯法(右)構建的廣頭葉蟬亞科系統發育樹Fig. 1 Phylogeny trees based on COⅠ gene sequences for Macropsinae using Maximum Likelihood (left) and Bayesian Inference (right)

3 討論

本文獲得了廣頭葉蟬亞科22種和片角葉蟬亞科1種共23條COⅠ基因的部分片段序列，其中，保守位點304個，變異位點338個，簡約信息位點289個，簡約信息位點占總位點數的45.0%，能夠較好地提供系統發育所需信息；T、C、A、G含量分別為35.7%、17.4%、32.6%、14.3%，AT偏倚明顯。不同種類間的遺傳距離平均值約為0.10，而不同階元間(種-屬-亞科)遺傳距離差異具有統計學差異。ML樹和BI樹較好地反映了中國廣頭葉蟬亞科屬間系統發育關系，支持了橫皺葉蟬屬和尖尾葉蟬屬的單系性，但廣頭葉蟬屬和暗紋葉蟬屬較為混亂。

3.1 COⅠ基因在廣頭葉蟬亞科物種鑒定中的應用

廣頭葉蟬亞科22種的種間遺傳距離大于Hebert等(2003a，2003b)推薦的區分物種的最小種間遺傳距離(0.02)，一定程度上說明了基于COⅠ基因的DNA條形碼對于鑒定廣頭葉蟬亞科種類是比較適用的。本文提供了22種廣頭葉蟬的DNA條形碼序列，為廣頭葉蟬亞科的分子鑒定提供了基礎數據。

3.2 廣頭葉蟬亞科的系統發育關系

廣頭葉蟬屬是廣頭葉蟬亞科中物種數最多的類群，其形態特別是外生殖器特征高度相似(Lietal.，2012，2013，2014)，所以從形態學上看，廣頭葉蟬屬的分類毋庸置疑，但從系統發育結果來看，該屬物種并未全部聚合成一支，其原因可能是存在趨同進化。鈍圓尖尾葉蟬Pedionisobtusata與橫皺葉蟬屬聚合支構成姊妹關系，對比其形態學特征發現，鈍圓尖尾葉蟬的陽莖、連索等特征完全符合尖尾葉蟬屬特點，說明尖尾葉蟬屬與橫皺葉蟬屬有較近的親緣關系。尖尾葉蟬屬除鈍圓尖尾葉蟬和南昆山尖尾葉蟬外，都能聚在一起，基本支持其單系性；鈍圓尖尾葉蟬如前所述，與橫皺葉蟬屬關系較近，而南昆山尖尾葉蟬和瘤突廣頭葉蟬Macropsistuberculiformis聚為一支，其原因尚需進一步研究。暗紋葉蟬屬最為混亂，而該屬也是目前廣頭葉蟬中最有爭議的一個屬，其分類地位可能存在問題；依Hamilton(1980)的系統，該屬包含5個亞屬，作者與俄羅斯學者Tishechkin博士(Department of Entomology，Faculty of Biology，M.V. Lomonosov Moscow State University，Vorobyevy Gory，Moscow，Russia)和日本學者Okudera博士(Entomological Laboratory，Faculty of Agriculture，Kyushu University，Fukuoka，Japan)交流，均表示該屬目前存在一些問題，但由于標本掌握不全，有些亞屬僅分布在新北區，有些僅分布在非洲區，加之該屬的形態特征高度近似，且存在交叉，因而無法提出合適的修訂意見；該屬的演化關系需在補充標本后進一步研究。

本文為廣頭葉蟬亞科系統發育關系提供了重要的基礎信息。昆蟲線粒體COⅠ基因被廣泛用于物種鑒定，因其序列片段較短，能夠提供用于系統發育構建的信息可能并不完整。本文中廣頭葉蟬屬、尖尾葉蟬屬和暗紋葉蟬屬的單系性并不理想，這樣的結果或許并不是分類本身的原因，也可能是由于當前的數據不足以支撐其構成單系，后續可獲取多基因的序列數據來進一步探討和完善中國廣頭葉蟬亞科的系統發育關系。