海南島泛樹蛙屬(兩棲綱：無尾目：樹蛙科)物種的 形態特征鑒定及其多樣性研究

劉秋成， 翟曉飛， 王同亮， 汪繼超

(海南師范大學生命科學學院，熱帶島嶼生態學教育部重點實驗室，海口571158)

泛樹蛙屬Polypedates隸屬樹蛙科Rhacophoridae，目前該屬共24個物種(Frost，2017)。國外對泛樹蛙屬物種的研究發現，該屬物種的分類及系統發生關系較為復雜，同時也存在諸多爭議(Brownetal.，2010；Sheridanetal.，2010；Riyantoetal.，2011；Kuraishietal.，2012)。在國內，Pan等(2013)在前人研究(Lietal.，2008，2009；Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2012)的基礎上，基于分子系統發育關系重新評估了P.leucomystax復合體的分類，發現其在東南亞地區有5個物種，其中，中國分布有斑腿泛樹蛙P.megacephalus、布氏泛樹蛙P.braueri、無聲囊泛樹蛙P.mutus和凹頂泛樹蛙P.impresus4個物種，模式產地分別是中國香港(Hallowell，1861)、中國臺灣(Vogt，1911)、緬甸N’Chang Yang(Smith，1940)和中國云南省普洱市(楊大同，饒定齊，2008)。這4個物種在中國的分布情況詳見表1(中國兩棲類，2018)。然而，泛樹蛙屬物種間的形態差異較小，繁殖模式和棲息地環境相似，其分類及分布目前仍然存在較大爭議。

表1 泛樹蛙屬物種在中國的分布Table 1 Distribution of Polypedates species in China

泛樹蛙屬物種在海南島也有分布，且體色變異較大，以往基于體色及背部有無“X”形斑等特征較難準確區分該屬物種(史海濤等，2011)。由于海南島地形和植被類型較為復雜，尚無在全島范圍內對泛樹蛙屬物種的系統調查，其物種多樣性及是否存在隱存種均不清楚。本研究基于全島范圍內的系統樣本采集，通過分子系統學分析，構建海南島泛樹蛙屬物種的分子系統發育關系，結合形態特征比較，探究海南島該屬物種多樣性與分布格局，同時通過不同物種間形態特征的詳細對比，總結可用于分類鑒定的典型形態特征，為其他地區該屬物種的分類鑒定提供依據，也為進一步開展該類群物種的景觀遺傳學和生物地理學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

研究地點位于中國海南島(108°36′45″～111°16′22″E，18°9′33″～20°9′42″N)，全島面積33 907 km2，屬低緯度熱帶季風氣候(王寶燦，2006)。2015年7月—2017年7月，根據海南島地形及泛樹蛙屬的生境類型，在全島范圍內選取了30個采樣點(表2，圖1)，共采集256號標本。采用GPS記錄采集點經度、緯度、海拔等信息，并對生境及形態拍照。

表2 泛樹蛙屬30個種群采集樣點Table 2 Sampling localities of 30 populations of Polypedates

圖1 海南島泛樹蛙屬物種調查取樣點
Fig. 1 The sampling points ofPolypedatesspecies on Hainan Island

1.2 形態鑒定與數據測量

參考《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》(費梁等，2012)對采集的所有泛樹蛙標本進行初步分類與鑒定，然后隨機選擇體長超過《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》中描述的斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙成體體長最小值的115號標本測量了形態指標(表3)。電子天平(SI234，丹佛儀器(北京)有限公司，精度0.1 mg)稱量體質量；數顯游標卡尺(10810206，廣州百威獅工具有限公司，精度0.01 mm)測量體長、頭長、頭寬、吻長、鼻間距、眼間距、上眼瞼寬、眼徑、鼓膜、前臂及手長、前臂寬、后肢全長、脛長、脛寬、附足長與足長等形態指標。數據以平均值±標準差表示。

1.3 系統發生關系構建

參考Kuraishi等(2013)和Pan等(2013)對東南亞地區泛樹蛙屬系統發育關系的研究，選取線粒體12SrRNA、16SrRNA基因片段作為遺傳標記對海南島泛樹蛙屬標本進行基因組DNA提取及目的基因擴增。擴增所用的引物序列為FS01：5’-AACGCTAAGATGAACCCTAAAAGTTCT-3’， Rend：5’-GACCTGGATTACTCCGGTCTGA-3’。以P.india、P.malaysia和P. sp.malaysia為外群，在Pan等(2013)研究結果的基礎上，加入通過形態特征初步鑒定的斑腿泛樹蛙(11個地理種群)和無聲囊泛樹蛙(4個地理種群)標本的序列，采用貝葉斯推斷法構建系統發生關系，以佐證形態特征鑒定的結果。

2 結果

2.1 形態特征分析

對采集的標本逐一進行詳細的形態特征比較與分析，發現海南島上僅分布斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。斑腿泛樹蛙在全島范圍內均有分布，而無聲囊泛樹蛙僅分布在海南島的吊羅山、白石嶺、五指山和尖峰嶺等中南部山區。斑腿泛樹蛙分布的最低海拔為4.9 m，海拔200 m以上為斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙的分布重疊區域。基于以下幾個關鍵的形態特征能將兩者進行準確分類：在體型方面，斑腿泛樹蛙身體寬而扁平，成體雄蛙體長50.28 mm±4.23 mm(n=59)，成體雌蛙體長69.36 mm±4.09 mm(n=27)，而無聲囊泛樹蛙身體窄長而扁平，成體雄蛙體長60.86 mm±4.51 mm(n=27)，成體雌蛙體長84.82 mm±3.27 mm(n=2)(表3)；在體側及其后半部斑紋方面：斑腿泛樹蛙體側無斑點，后半部有網紋(圖2：a)，而無聲囊泛樹蛙體側有大的黑褐色點斑綴成連續狀，體側后半部無網紋(圖2：c)；在股后部斑點方面：斑腿泛樹蛙股后部斑點小而密集(圖2：b)，無聲囊泛樹蛙則大而稀疏(圖2：d)。此外，斑腿泛樹蛙后肢粗壯，脛跗關節前伸達眼與鼻孔之間，而無聲囊泛樹蛙后肢細長，脛跗關節前伸達吻端或鼻孔。

2.2 海南島泛樹蛙與東南亞其他泛樹蛙的系統發育關系

基于貝葉斯法構建的系統發育關系與Kuraishi等(2013)、Pan等(2013)的拓撲結構基本一致，明顯分成了5個支系(Clade A～E)，且每個支系后驗概率較高(≥0.97)(圖3)。Clade A包含斑腿泛樹蛙模式產地中國香港的標本序列，還有廣西、廣東及越南，泰國的斑腿泛樹蛙標本序列，這些序列和所有本研究基于形態特征初步鑒定出來的海南島斑腿泛樹蛙標本序列一起構成了Clade A，與來自菲律賓、印度尼西亞和緬甸的P.leucomystax(Clade B)構成了姐妹群。Clade A與Clade B一起與Clade C構成姐妹群，Clade C包含來自老撾和中國云南的凹頂泛樹蛙。Clade D包括來自重慶、云南和廣西的布氏泛樹蛙，與前面4支構成姐妹群。Clade E包括中國廣西和越南的無聲囊泛樹蛙以及本研究基于形態特征鑒定的海南島的無聲囊泛樹蛙種群標本序列。通過形態特征比較和分子生物學數據分析，沒有發現隱存種。

表3 海南島泛樹蛙屬物種形態學特征Table 3 Morphological characteristics of Polypedates on Hainan Island

圖2 斑腿泛樹蛙側面觀(a)和股后部(b)， 無聲囊泛樹蛙側面觀(c)和股后部(d)Fig. 2 The side view (a) and posterior portion (b) of Polypedates megacephalus and the side view (c) and posterior portion (d) of P.mutus

圖3 基于線粒體12S rRNA、16S rRNA基因構建的泛樹蛙屬系統發育關系樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Polypedates based on the mitochondrial 12S rRNA and 16S rRNA gene

3 討論

此前對海南島泛樹蛙屬物種的分子生物學研究僅基于海南島局部區域采集的少量標本，并未對全島進行大范圍的采樣，由于種間特征相似，僅依靠形態或分子生物學手段得出的結果缺乏相互的佐證。因此，對海南島泛樹蛙屬物種的分類與分布格局一直存在爭議(Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通過系統調查取樣，把在海南島采集的所有泛樹蛙屬物種樣本的線粒體12SrRNA和16SrRNA基因序列與P.leucomystax復合體已知序列構建系統發育樹，發現海南島所有樣本只分布在2個支系上，分別是斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。因此，確認了海南島僅分布有斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙。斑腿泛樹蛙在全島均有分布，而無聲囊泛樹蛙僅分布在海南島中南部山區。斑腿泛樹蛙作為海南島廣泛分布的物種，其種群的遺傳結構特點及其可能存在的遺傳分化值得進一步研究。

斑腿泛樹蛙早期被認為是P.leucomystax的亞種(Stejneger，1925；Pope，1931；Inger，1966)，中國學者認為是P.leucomystax的同物異名(Liu，1950；劉承釗，胡淑琴，1961)。Matsui等(1986)通過對分布在中國臺灣和婆羅洲的種群進行比較分析，認為斑腿泛樹蛙不是P.leucomystax的同物異名。隨后，中國的一些分類學者也認為中國大陸的種群都是斑腿泛樹蛙(Zhao & Adler，1993；費梁，1999；費梁等，2005，2009)。Liu等(1960)在云南河口采到背部有條紋卻沒有聲囊的泛樹蛙屬的物種標本，認為該物種為無聲囊泛樹蛙。Inger等(1999)也認為華南地區沒有聲囊的標本是無聲囊泛樹蛙。楊大同和饒定齊(2008)于云南省普洱市發現了一泛樹蛙屬的新種，并將其命名為凹頂泛樹蛙，后來該物種的有效性也得到了分子生物學的驗證(Panetal.，2013)。Kuraishi等(2011)對斑腿泛樹蛙模式產地香港種群與臺灣種群的標本在分子生物學、鳴聲特征以及形態學方面做了比較研究，認為這2個地理種群存在明顯差異，明確了臺灣種群是布氏泛樹蛙而不是斑腿泛樹蛙。隨后一些學者通過進一步的分子系統學研究，發現中國分布的泛樹蛙為多個物種(Brownetal.，2010；Kuraishietal.，2013；Panetal.，2013)。本研究通過分子生物學手段，驗證了對海南島泛樹蛙屬物種鑒定所參考形態特征的準確性，發現以往采用物種的體色和體背“X”形斑等特征不能準確區分海南島的泛樹蛙屬物種。本研究通過詳細的標本對比，認為體型、體側斑點及其后半部網紋、股后部斑點和脛跗關節前伸至眼/鼻/吻端的位置等特征可作為準確鑒別斑腿泛樹蛙和無聲囊泛樹蛙的穩定且典型的形態特征。運用該形態特征鑒定的結果與分子數據鑒定結果一致，這些特征可為其他分布區對這2個物種的分類鑒定提供參考。

斑腿泛樹蛙為全島廣泛分布的物種，種群數量相對較多，但無聲囊泛樹蛙僅分布于海南島中南部山區，分布區狹窄，種群數量相對較少，其棲息地為生境保存相對完好的次生林和原始雨林區，作為一個重要的環境指示物種，應加大保護力度，降低人為干擾和棲息地破壞。

致謝：海南師范大學碩士研究生陳一帆及本科生張豪在野外采樣過程中給予幫助；北京林業大學博士研究生黃勇杰在分子生物學數據處理中給予指導和幫助，在此一并表示感謝。