生脈注射液聯合長春新堿對人骨肉瘤細胞增殖影響的研究

伊雅淞 鞠增睿 韓呼日查 李宏遠 侯毅鞠

摘 要：目的：通過對人骨肉瘤細胞G292的培養，研究生脈注射液聯合長春新堿對癌細胞生長的影響，為進一步研究對抗癌細胞奠定基礎。方法：培養人骨肉瘤細胞G292，取對數生長期的細胞進行實驗。用不同濃度的生脈注射液，長春新堿，生脈注射液聯合長春新堿作用于人骨肉瘤細胞G292。加藥培養48小時后，顯微鏡下進行細胞形態學觀察，MTT法測定，藥物敏感性檢測。結果：細胞形態觀察結果顯示藥物對細胞生長具有抑制作用；MTT法結果顯示聯合應用抑制率高于長春新堿抑制率；藥物敏感性檢測結果顯示生脈注射液聯合長春新堿作用效果為相加作用。結論：生脈注射液聯合長春新堿用藥對細胞的抑制作用比單獨用藥更明顯，且作用效果為相加作用。

關鍵詞：人骨肉瘤細胞；長春新堿；生脈注射液；聯合用藥

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）17-0200-02

長春新堿（VCR）是夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿，針對抗腫瘤細胞具有良好作用[1]。生脈注射液（SM）主要成分為紅參，麥冬，五味子。生脈注射液功能主治心悸，氣短休克等癥狀[2]。實驗以人骨肉瘤G292細胞株為受試對象，研究生脈注射液和長春新堿及聯合應用此兩類藥物對接受藥物作用的人骨肉瘤細胞G292生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

G292細胞株；生脈注射液；長春新堿；新生牛血清；1640培養基。

1.2 細胞培養

配制血清濃度為12.5%的1640培養基，將G292細胞放置溫度37±1℃ 5%CO2培養箱中貼壁生長，恢復至對數增長期，在超凈臺內進行試驗。

1.3 試驗分組

將細胞共分為A、B、C、三組，分別為空白組，應用生脈注射液組（10、20、50、100μl/ml），應用長春新堿組（5、10、20、50μg/ml），生脈注射液聯合長春新堿應用組（生脈30μl/ml聯合長春新堿5、10、20、50μg/ml）。

1.4 細胞形態學觀察

在加入藥品培養48小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及數量，初步判斷藥物及藥物聯合應用對G292細胞的影響。

1.5 細胞生長抑制實驗

指數生長培養的G292細胞以5×104個細胞/孔的終濃度接種到96孔板，每孔200μl，細胞分別以不同濃度的生脈注射液培養48h后，向每個孔中加入20μL MTT（5mg/ml）。孵育4h后，吸棄培養基，紫色甲瓚晶體溶解于150μL/孔溫的DMSO中。使用酶聯免疫分析儀測定570nm處的吸光度。細胞的存活率以對照孔的百分比表示。每次測定重復三次，以確保可靠性。

1.6 藥物敏感性檢測

指數生長培養的G292細胞，以5×104個細胞/孔的終濃度接種到96孔板，每孔200μl，細胞分別以不同濃度的長春新堿（5、10、20、50μg/ml），生脈30μl/ml聯合長春新堿5、10、20、50μg/ml用藥處理，培養48h后后續操作同1.5，并計算增敏倍數。化療增敏倍數=單用化療藥物IC50/聯合用藥時化療藥物IC50。聯合治療效果常采用金正均Q值法評價：Q=EA+B/（EA+EB-EA·EB）。EA代表A藥單獨給藥時的抑制率，EB代表B藥單獨給藥時的抑制率，EA+B代表A、B兩藥合并給藥后的抑制率，0.85≤Q≤1.15為相加作用，Q>1.15為協同作用，Q<0.85為拮抗作用。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

分別加入對應藥品培養48小時后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態如圖1。

由圖1可見，生脈注射液30μl/ml組的細胞間距增加，長春新堿10μg/ml組細胞數量減少，濃度增加到50μg/ml后，細胞形態異常，生長狀態不良。與生脈注射液聯合用藥后，長春新堿10μg/ml組細胞形態改變顯著，細胞邊界模糊，細胞內出現大量顆粒，長春新堿50μg/ml組細胞生長狀態極差，細胞數量急劇減少，出現大量死亡細胞，成明顯抑制。

2.2 細胞生長抑制實驗

生脈注射液能有效抑制G292細胞的增殖，如圖2所示， 10、20、50、100μl/ml體積分數的生脈注射液作用于G292細胞48h的生長抑制率為15.85%、27.02%、47.53%、63.38%、且其抑制作用呈濃度依賴性。IC50濃度為65.65μl/ml。

2.3 生脈注射液聯合長春新堿對G292細胞藥物敏感性的影響

選用體積分數為30μl/ml的生脈注射液與不同濃度的長春新堿聯合使用，觀察生脈注射液對長春新堿抗腫瘤增殖的相加作用，如圖3所示，IC50濃度為39.14μg/ml，體積分數為30μl/ml的生脈注射液與不同濃度的長春新堿（5、10、20、50μg/ml）聯用Q值分別為0.86、0.97、1.02、0.91。表現為相加作用，IC50濃度為3.04μg/ml，增敏倍數為12.875。

3 討論

人骨肉瘤發病率在原發性惡性腫瘤中占據首位，該瘤惡性程度甚高，愈后極差且腫瘤細胞原發或繼發的耐藥問題[3]，可于數月內出現肺部轉移，截肢后3～5年存活率僅為5～20%。通過研究發現長春新堿是作用于細胞周期的一種特異性藥物，一般在S期通過與微觀蛋白結合，阻斷細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖[4-5]。生脈注射液主要成分為中藥紅參、麥冬、五味子等，最新研究發現生脈注射液也具有一定的抗腫瘤作用且可以加強化療療效、減輕化療藥物的毒副作用、提高患者生存質量。通過本實驗結果可知，生脈注射液或長春新堿單藥均有抑制G292細胞增殖的作用，藥敏分析表明，聯合用藥效果為相加作用。以本研究結果作為依據，可為臨床腫瘤治療提供更多治療方案，以此減低腫瘤患者化療副作用，提高生存質量，但藥物聯合作用機制需要進一步研究。

參考文獻

[1]周洪玉.生脈注射液藥效物質基礎研究[D].吉林大學，2011.

[2]盧懿，侯世祥，陳彤.長春花抗癌成分長春新堿研究的進展[J].中國中藥雜志，2003，（11）：13-16.

[3]王家騏，梅炯，蔡宣松.骨肉瘤化療的現狀和研究進展[J].同濟大學學報：醫學版，2004，25（6）：538-540.

[4]Novotny N M， Markel T A，Crisostomo P R，et al. Differential IL-6 and VEGF secretion in adult and neonatal mesenchymal stem cells： role of NF-κB[J].Cytokine，2008，43（2）：215-219.

[5]Lecland N， Lüders J. The dynamics of microtubule minus ends in the human mitotic spindle[J].Nat Cell Biol， 2014， 16（8）： 770-778.

[6]Colabufo N A，Berardi F，Contino M，et al.ABC pumps and their rolein active drug transport[J].Curr Top Med Chem，2009，9（2）：119.