轉染CXCR4的MSCs對放射性肺損傷組織中細胞因子的影響

張春陽，祝 艷，馮華松

目前針對放射性肺損傷(RILI)，仍缺少有效的治療手段。研究發現，間充質干細胞（MSCs）具有減輕放射性肺損傷、肺纖維化的作用[1]，且目前已開展臨床試驗研究探索[2]，但具體的作用機制仍不完全清楚。研究發現，通過提高MSCs上CXCR4基因的表達后，可增強其向受損傷組織部位的歸巢，提升治療效果[3]。前期研究中[4]，筆者已證實通過慢病毒轉染，使來源于臍帶的MSCs過表達CXCR4基因后，MSCs的趨化、遷移能力提高。目前國內尚無關于病毒轉染CXCR4的MSCs對RILI中細胞因子影響的報道。本研究通過觀察慢病毒轉染CXCR4的MSCs對參與放射性肺損傷的10 kDa干擾素γ誘導蛋白（IP-10）、轉化生長因子 β1（TGF-β1）、血小板源生長因子 (PDGF)、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)和基質金屬蛋白酶（MMPs）-2的影響，探討轉染CXCR4的MSCs治療RILI可能的機制，為MSCs在臨床中的應用提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源與準備 新生兒臍帶來源于醫院婦產科，經醫院倫理委員會批準，與產婦及家屬簽署知情同意書后，無菌條件下留取剖宮產的足月健康新生兒臍帶，經組織塊法貼壁培養[5]，實驗采用第3代細胞。MSCs已進行多向分化和免疫表型鑒定[5]。通過慢病毒轉染第3代MSCs，治療組細胞采用攜帶 CXCR4和 EGFP的慢病毒載體（LV-CXCR4-EGFP），對照組細胞采用僅攜帶EGFP的慢病毒載體（LV-EGFP）進行轉染，具體方法見參考文獻[4]。

1.1.2 主要試劑及設備 CXCR4基因設定來源于人類，GENE ID為 7852，Genebank編號為 NM_001008540。CXCR4慢病毒載體，由上海吉凱基因化學技術有限公司協助構建，載體為GV287，分子量為 10.4 kb，元件順序為：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位點為AgeI/AgeI。C57雌性小鼠，購自軍事醫學科學院，動物合格證號：SCXK-（軍）2012-0004。DMEM/F12培養基、青霉素、鏈霉素（Hyclone公司，美國），胰蛋白酶（Trypsin）（Invitrogen 公司，美國），胎牛血清(FBS)（Gibco 公司，美國），羥脯胺酸（HYP）、丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（華美生物有限公司），PDGF、TGF-β1 ELISA 試劑盒（Abcam 公司，美國），TNF-α ELISA試劑盒（Abcam公司，美國）。熒光倒置顯微 鏡 （Olympus 公司，CKX-41，日本），酶標儀（Thermo 公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建放射性肺損傷小鼠模型 將24只雌性出生后2個月左右的C57小鼠，隨機分為4組：正常組、照射組、對照組和治療組，每組各6只。照射組、對照組和治療組小鼠腹腔注射5%水合氯醛（每只0.006 ml/g）麻醉后，呈俯臥位固定鼠板上。調整直線加速器照射野，設定照射參數(13 Gy，6 MV，3.68 Gy/min)，窗寬 20 cm×2.5 cm，源距 1 m，給予全肺一次性X線照射。照射之后，將小鼠放置動物房繼續飼養。

1.2.2 各組干預措施 對照組和治療組于放射線照射后第1 d，分別自小鼠尾靜脈注射LV-EGFP和LV-CXCR4-EGFP轉染后的MSCs，每只細胞數量5×105/0.2 ml。正常組和照射組，分別經尾靜脈注射約0.2 ml的0.9%生理鹽水。

1.3 熒光顯微鏡觀察 放射線照射后的第7 d，處死小鼠后留取肺組織檢測。取小鼠右肺下葉肺組織標本，進行冰凍切片，厚度5 μm；用含DAPI的甘油封片劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP標記的MSCs在肺組織的分布情況。

1.4 病理組織學觀察 左肺下葉標本進行石蠟包埋、切片，厚5 μm，行HE染色，光鏡下觀察病理組織學的變化。

1.5 ELISA檢測 取小鼠右肺上葉標本，組織勻漿后，采用相應的ELISA試劑盒檢測HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和 MMP-2 的含量。

1.6 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件分析數據，實驗數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs在肺組織中分布 熒光顯微鏡觀察發現，對照組和治療組肺組織內有綠色熒光表達的細胞，且治療組表達綠色熒光的細胞數量多于對照組；而照射組肺組織內未見明顯的綠色熒光表達（圖1）。

圖1 熒光顯微鏡檢測小鼠肺組織內EGFP標記的MSCs分布

2.2 病理組織學觀察 HE染色可見，正常組肺組織肺泡壁完整，肺間質無增厚，無明顯的炎性細胞滲出、浸潤，結構組織清晰（圖2a）；照射組肺組織可見肺泡間隔增厚，伴有大量炎性細胞浸潤，部分肺泡腔逐漸變小，部分萎陷，肺泡正常結構破壞（圖2b）；治療組和對照組肺組織內，亦可見局部肺泡間隔增厚，炎性細胞浸潤，但肺泡間隔增厚程度明顯較照射組減輕，肺泡組織結構破壞也較照射組明顯減輕（圖 2c、d）。

圖2 小鼠肺組織病理組織學HE染色

2.3 ELISA檢測結果 與正常組比較，照射組肺組 織 內 HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和MMP-2表達明顯升高（P＜0.01），而治療組和對照組較照射組明顯下降（P＜0.01）。與對照組比較，除TNF外，治療組其他指標下降的更加明顯（P＜0.01）。見表1。

3 討論

本研究發現，治療組肺組織內EGFP標記的MSCs數量比對照組增多，提示轉染CXCR4后MSCs歸巢能力提高，與前期體外研究的結果相符合[4]。同時，組織病理學結果和反映組織氧化應激損傷的MDA和纖維化程度的HYP含量檢測發現，轉染CXCR4的MSCs較對照組MSCs，更明顯地減輕放射線導致的氧化應激反應，并減少HYP的升高，提示其具有更好的減輕RILI作用。

RILI發生、發展過程中，涉及多種細胞因子和靶細胞相互作用，有促進和修復作用的細胞因子是影響 RILI發展趨勢的主要因素[6]。IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMPs被認為具有參與損傷、介導炎癥反應、促進纖維化形成的作用[6]。IP-10是屬于CXC趨化因子家族的促炎細胞因子，在免疫系統不同的細胞系中起到誘導趨化性作用[7]，被認為參與介導RILI免疫反應[6]。TGF-β1是致纖維化細胞因子，被認為是放射性肺損傷重要的標志物之一[8]，給予輸注MSCs后，可降低RILI小鼠體內TGF-β1的水平[9]。PDGF具有趨化炎癥細胞、成纖維細胞的作用，使肺內成纖維細胞分裂和增殖增加，促進纖維化的形成[10]。TNF-α是促炎性反應的細胞因子[10]，在RILI的發生和維持過程中具有重要作用。MSCs通過拮抗TNF-α阻斷纖維化信號通路[11]。研究發現[12]，肺纖維化早期階段，MMPs的水平升高，降解細胞外基質的作用增強，從而損傷肺組織。本研究發現，上述細胞因子在放射線照射后小鼠肺組織內表達均明顯升高，與文獻報道相一致。而在給予MSCs后，其表達水平均顯著下降，其中轉染CXCR4的MSCs相對于對照組，其抑制作用更加明顯，提示轉染CXCR4的MSCs具有更好的抑制放射線照射致細胞因子異常表達作用，從而減輕RILI。這有可能與提升MSCs趨化歸巢能力后，使進入局部損傷組織的MSCs增多有關，但不能排除局部由于過表達CXCR4后，影響了RILI組織內其他的信號通路機制導致有關，還需要進一步研究明確。

表1 各組ELISA檢測結果比較(n=6)

綜上所述，通過輸注轉染CXCR4的MSCs可更好地減輕RILI，更有效地抑制參與RILI細胞因子的異常升高，為今后利用基因修飾的MSCs治療RILI提供有力的理論依據。