葛根中葛根素與大豆苷元超聲提取工藝研究

崔 穎 ，劉馨湄 ，才 鳳

（1．遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034； 2．遼寧省食品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110015）

葛根為豆科野葛Pueraeia lobata（Willd．）Ohwi或甘葛藤Pueraeia thomsoniiBenth．的干燥根，為臨床常用中藥，《本草綱目》載其性涼、氣平、味甘，具清熱、降火、排毒功效。民間用葛根退熱生津。葛根含12%的黃酮類化合物，如葛根素、大豆黃酮苷、花生素等營養(yǎng)成分，還含有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖和人體必需的鐵、鈣、銅、硒等礦物質(zhì)，是老少皆宜的名貴滋補品，有“千年人參”之美譽［1-2］。傳統(tǒng)的提取方法有冷浸法、加熱回流法、水煎煮法、滲漉法等［3-10］，但其提取速度慢、耗能，無法充分利用葛根活性物質(zhì)，造成資源浪費。本試驗中采用低溫超聲裂解法破碎細胞，加速有效成分進入溶劑，縮短提取時間，減少高溫對提出成分的影響，并將有效物質(zhì)釋放出來，以最大限度地提高利用率。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LGJ-12型冷凍干燥機（北京松源華興科技有限公司）；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南鞏義市予華儀器有限公司）；BS224S型分析天平（德國賽多利斯儀器公司）；JY98-ⅢDN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LC-10P型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1．2 試藥

葛根藥材（亳州春雷藥材有限公司）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為752-200508）；大豆苷元對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110752-200511）。所用試劑均為分析純，供試液均按2010年版《中國藥典》附錄配制。

2 方法與結(jié)果

2．1 藥材鑒定

葛根為豆科野葛Pueraeia lobata（Willd．）Ohwi或甘葛藤Pueraeia thomsoniiBenth．的干燥根，經(jīng)遼寧省中醫(yī)藥研究院主任藥師劉景文鑒定，符合2010年《中國藥典（一部）》［11］葛根項下有關(guān)規(guī)定。

2．2 葛根素及大豆苷元含量測定

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Spherigel C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水，梯度洗脫（梯度洗脫條件見表1）；檢測波長：250 nm；流速：1．0 mL ／min；進樣量：10 mL；柱溫：30℃。理論板數(shù)按葛根素峰計不低于4000。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件

圖1 高效液相色譜圖

2．2．2 溶液制備

精密稱取葛根素對照品和大豆苷元對照品適量，加甲醇溶解并定容至刻度，制得每1 mL含葛根素8 μg和大豆苷元10 μg的混合溶液，作為對照品溶液。

取本品粉末（過 3號篩）0．1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min，放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對照品溶液3，5，10，15，20 μL 進樣，按 2．2．1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得葛根素回歸方程Y＝37 700 889X+7 451，R＝0．9997（n＝5），進樣量線性范圍為0．024～0．160μg；大豆苷元回歸方程為Y＝674 583X-403．6，R＝0．999 7（n＝5），進樣量線性范圍為 0．03 ～0．20 μg。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣 6次。結(jié)果的RSD為0．76% （n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時進樣，測定峰面積。結(jié)果葛根素和大豆苷元峰的RSD分別為 1．00% 和 1．10% （n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密稱取6份樣品，依法制得供試品溶液，進樣測定。結(jié)果葛根素和大豆苷元峰面積的RSD分別為0．80%和0．90%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

回收率試驗：稱取已知含量供試品粉末6份，每份0．05 g，精密稱定，加葛根素對照品 0．18 mg，大豆苷元對照品 0．25 mg，按 2．2．1項下色譜條件測定并計算。結(jié)果葛根素和大豆苷元的回收率分別為99．87%和100．32%，RSD分別為 0．70%和 1．80% （n＝6）。

2．2．4 樣品含量測定

精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果葛根素含量為40 mg／g，大豆苷元含量為 1．06 mg ／g。

2．3 提取工藝正交試驗

取野葛藥材300 g，破碎備用。根據(jù)野葛中葛根素的理化性質(zhì)，以水作為溶劑進行超聲提取，按L9（34）表進行正交試驗，采用高效液相色譜法［12-14］，以葛根素、大豆苷元為考察指標(biāo)，以加水量（因素A）、提取時間（min）（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為考察因素，優(yōu)選葛根超聲提取最佳工藝。因素水平表見表2，試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。影響水提效果的因素順序為A＞C ＞ B。查表得F0．05（2．2）＝ 19．00，F(xiàn)0．01（2．2）＝ 99．00，方差分析結(jié)果表明，因素A、因素B、因素C具有顯著性意義，表明本試驗設(shè)計較有意義。結(jié)合R水平，得出葛根素、大豆苷元最佳提取工藝為A1B3C3，即加8倍量水，每次提取30 min，提取3次。

表2 因素水平表

表4 方差分析表

2．4 驗證試驗

稱取藥材5份，精密稱定，按最佳提取條件進行提取、濃縮，分別測定葛根素、大豆苷元總量。結(jié)果見表5。得出的數(shù)據(jù)與正交試驗直觀分析得出的結(jié)論相吻合，本試驗中確定的水提工藝可行、穩(wěn)定、合理。

表5 最佳工藝驗證試驗結(jié)果

2．5 葛根收率

將2．4項下的5份提取液合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀適當(dāng)濃縮，利用冷凍干燥技術(shù)［15］進行干燥，溫度為-60℃，預(yù)凍4 h，然后在程序升溫曲線條件下干燥28 h，即得。計算葛根的收率為52．4%，程序升溫曲線見圖2。

圖2 葛根的程序升溫曲線

3 討論

通過單因素和正交試驗，優(yōu)化了超聲提取的工藝條件，確定最佳提取工藝為加8倍量水，提取3次，每次提取30 min。該試驗以水溶液為提取劑，成本低廉，工藝操作簡單，且提取過程中未加入任何有毒物質(zhì)，因此安全性較高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)于葛根藥材成分提取的研究報道很多，提取過程中影響因素很多，優(yōu)化時所考慮的影響因素不同，各因素水平也不相同，同時各因素間又相互影響，因而在提取過程中要綜合考慮各種因素，以保證最佳提取工藝優(yōu)化的確定性。結(jié)合文獻研究和預(yù)試驗，本研究中以水為提取溶劑，并以低溫超聲的提取方式進行提取，以葛根主要化學(xué)成分和活性成分葛根素、大豆苷元的含量作為考察指標(biāo)，專屬性強，并采用正交試驗，確定最佳提取工藝。優(yōu)選的工藝簡單、穩(wěn)定、可行，可控性良好。本研究中采用低溫冷凍干燥技術(shù)對葛根提取物進行干燥，不但脫水較徹底，且干燥后的多肽成分性質(zhì)穩(wěn)定，便于長時間貯存，能更好地控制溫度，保護活性成分。