沉默纖維介素2基因表達對急性壞死性胰腺炎小鼠的治療作用

邵利梅 葉曉華 丁進

纖維介素2(fibrinogen-like protein 2, FGL2)為纖維蛋白原超家族成員，在體內存在兩種形式，即膜型FGL2(mFGL2)和分泌型FGL2(sFGL2)，mFGL2具有凝血酶原酶活性，可通過介導各臟器內微血栓的形成引起器官損傷，sFGL2是T細胞的效應分子，發揮免疫調節活性，防止組織損傷[1]。Xi等[2]報道，沉默MHV-3誘導的暴發性肝炎小鼠的FGL2基因表達可減輕肝細胞的壞死和凋亡。葉曉華[3]報道，急性壞死性胰腺炎(acute necrotic pancreatitis, ANP)大鼠胰腺組織FGL2 表達升高，且與細胞凋亡密切相關。故本研究構建攜帶靶向FGL2的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的腺病毒(Ad-FGL2-siRNA) ，探討FGL2在ANP小鼠胰腺細胞凋亡中的作用及機制。

材料與方法

一、材料及試劑

健康SPF級雄性C57/BL小鼠由上海實驗動物研究中心提供。飼養在安靜、恒溫恒濕、12 h自然光照與黑暗交替、食水持續供給的環境中，所有操作均遵守浙江大學金華醫院動物保護條例。牛磺膽酸鈉購自美國Sigma公司，ELISA試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司，SYBR Green Master Mix購自美國Life technologies公司，FGL2抗體購自美國Santa Cruz公司，EnVision試劑盒購自丹麥Dako公司，TUNEL凋亡試劑盒購自瑞士Roche公司。

二、動物分組及模型制備

實驗前動物禁食12 h，不禁水。采用腹腔內注射10%水合氯醛(2 ml/kg體重)麻醉，將小鼠分為對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組，每組6只。對照組開腹輕翻動胰腺組織后關腹；ANP組采用胰膽管逆行注射4%牛磺膽酸鈉溶液(1 ml/kg體重)方法誘導ANP模型；Ad-FGL2-siRNA組在造模前經尾靜脈注射0.5 ml 4×108pfu/ml的Ad-FGL2-siRNA。對照組及ANP組經尾靜脈注射等劑量不攜帶Ad-FGL2-siRNA的腺病毒。術后6 h處死小鼠，抽取下腔靜脈血0.5 ml，分離血清，置-20℃冰箱保存；取胰腺組織標本，部分置于4%多聚甲醛保存，部分經液氮速凍后置-80C°冰箱保存。

Ad-FGL2-siRNA由上海銳賽生物科技有限公司設計并構建。靶向FGL2的siRNA正向序列為5′-TGCTGTTCTTTGAGCACCTCCTCCATGTTTTGGCCA-CTGACTGACATGGAGGATGCTCAAAGAA-3′，反向序列為5′-CCTGTTCTTTGAGCATCCTCCATGTCAGTCAGTGGCCAAAACATGGAGGAGGTGCTCAAAGAAC-3′。

三、胰腺組織病理學檢查

取固定的胰腺組織常規行病理學檢查。光鏡下隨機選取10個視野，根據Schmidt等[4]的標準對胰腺損傷的水腫、出血、腺泡細胞變性和間質炎癥進行評分。

四、血清TNF-α和IL-1β水平檢測

采用ELISA法測定血清TNF-α和IL-1β水平，按試劑盒說明書操作。根據標準品的A450值繪制標準曲線，獲取二元方程式，計算待測標本的TNF-α和IL-1β水平。

五、胰腺組織FGL2 mRNA及蛋白表達檢測

應用Trizol法提取胰腺組織RNA，反轉錄成cDNA后應用美國ABI 7500型實時熒光定量PCR儀進行擴增。FGL2正義引物序列為5′-TGCCTTGCGTTTCAGTCG-3′，反義引物序列為5′-AATCCCATTACGGACACCTTT-3′。內參β-actin正義引物序列為5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3′，反義引物序列為5′-TCATACCAGGAAATGAGCTTGAC-3′。每個樣本做3個復孔，以雙蒸水代替cDNA模板作為空白對照。應用公式2-ΔΔCt計算FGL2 mRNA表達量。

應用RIPA裂解液提取速凍胰腺組織的總蛋白，使用BCA法定量蛋白后常規行蛋白質印跡法檢測FGL2蛋白，以β-actin作為內參。FGL2一抗工作濃度1∶200，最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影。采用Image J軟件進行條帶掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

同時，取固定的胰腺組織，常規制備切片，采用免疫組織化學法檢測FGL2蛋白表達，以BSA代替一抗作為對照，依據EnVision試劑盒說明書操作。FGL2一抗工作濃度1∶50，辣根過氧化物酶標記的二抗工作濃度1∶1 000，最后DAB 顯色劑顯色，蘇木素復染。以胞質染為淡黃色至棕褐色為陽性細胞標志，主要浸潤于微血管的內皮細胞和間質組織。在200倍光鏡下隨機選取10個不同視野，陽性細胞率為陽性細胞數/總細胞數×100%，取均值。

六、胰腺組織細胞凋亡檢測

采用末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynu-cleotidyl transferase，TdT)介導dUTP缺口末端標記法檢測胰腺組織細胞凋亡，按試劑盒說明書操作。用標準的熒光過濾裝置在(520±20)nm的熒光下觀察，綠色熒光為凋亡細胞，鏡下計數凋亡細胞。

七、統計學處理

結 果

一、各組小鼠胰腺組織的病理學改變

對照組胰腺組織學形態保持正常，ANP組的胰腺組織表現為水腫、出血、腺泡欠完整和炎癥細胞浸潤，Ad-FGL2-siRNA組胰腺組織的病理損傷較ANP組明顯減輕(圖1)。對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織的病理評分分別為(1.33±0.21)、(9.17±0.98)、(6.26±0.52)分，ANP組較對照組顯著升高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，但仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

二、各組小鼠血清 TNF-α、IL-1β水平變化

對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠血清TNF-α 水平分別為(63.8±4.2)、(240.4±18.6)、(123.0±10.3)ng/L；IL-1β水平分別為(43.6±4.4)、(186.6±18.7)、(92.0±10.9)ng/L。ANP組較對照組顯著增高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，但仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

圖1 對照組(1A)、ANP組(1B)、Ad-FGL2-siRNA組(1C)小鼠胰腺組織病理學改變(HE ×200)

三、各組小鼠胰腺組織FGL2mRNA及蛋白表達變化

對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織FGL2 mRNA相對表達量分別為1.20±0.22、4.40±1.21、2.15±0.56，ANP組較對照組顯著增高，Ad-FGL2-siRNA組較ANP組顯著下降，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，而Ad-FGL2-siRNA組FGL2 mRNA表達量雖高于對照組，但差異無統計學意義。

對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織FGL2蛋白相對表達量分別為0.33±0.08、1.23±0.24、0.68±0.09(圖2)，FGL2陽性細胞率為(2.56±0.31)%、(15.10±3.23)%、(8.68±1.81)%(圖3)，ANP組均較對照組顯著增加，Ad-FGL2-siRNA組均較ANP組顯著減少，但仍顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

四、各組小鼠胰腺組織細胞凋亡數

對照組、ANP組、Ad-FGL2-siRNA組小鼠胰腺組織內細胞凋亡數分別為(4.51±1.21)、(35.81±4.11)、(11.79±3.02)個/200倍視野，ANP組、Ad-FGL2-siRNA組顯著多于對照組，Ad-FGL2-siRNA組又較ANP組顯著減少，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。

圖2 對照組(1)、ANP組(2)、Ad-FGL2-siRNA組(3)FGL2蛋白表達(蛋白質印跡法)

圖3 對照組(3A)、ANP組(3B)、Ad-FGL2-siRNA組(3C)FGL2蛋白表達(免疫組織化學染色 ×200)

討 論

ANP早期很多因素可引起胰腺腺泡細胞的損傷或死亡，腺泡細胞壞死會提高胰腺細胞內的胰蛋白酶活性，釋放多種炎癥因子，激活炎癥級聯反應，而壞死-凋亡轉變機制在病情的嚴重程度方面起了極大的作用[5-7]。針對重癥急性胰腺炎(SAP)的免疫細胞的成熟、凋亡、分化等進行調控，是近幾年來ANP治療領域的方向之一[8]。FGL2屬于纖維蛋白原家族，由活化的巨噬細胞和內皮細胞表達，能催化凝血酶原轉化為凝血酶，啟動凝血過程。FGL2可參與ANP大鼠微血栓形成，促進了SAP的發生與發展[3,9]。本課題組既往的研究表明，FGL2在ANP動物模型及SAP患者外周血高表達，引起ANP相關性肝損傷的肝細胞微血栓形成[10]，并與一些其他疾病的細胞凋亡密切相關。腺病毒介導的微小RNA靶向調節mfgl2、mFas和mTNFR1，能明顯改善爆發性肝衰竭的肝細胞壞死和凋亡[2]；進一步研究表明IL-33通過靶向FGL2保護重癥病毒性肝炎小鼠[11]；此外，沉默FGL2也可抑制心肌細胞的凋亡，改善糖尿病大鼠的心功能[12]。但FGL2對ANP細胞凋亡及疾病進展的作用尚不清楚。

復制缺陷型腺病毒是最先進、研究最好的載體系統之一，可高水平表達外源基因[13]，既往實驗表明Ad-FGL2-siRNA對體外靶基因有明確的抑制作用[2]。本研究首次在ANP小鼠模型中通過Ad-FGL2-siRNA沉默FGL2基因來研究其作用，結果表明，FGL2基因沉默可顯著緩解ANP的胰腺病理學損傷，減少胰腺組織的水腫、出血、腺泡破壞和炎癥細胞浸潤，提示了FGL2基因沉默對ANP的保護作用。此外，免疫細胞， 特別是與先天免疫相關的炎癥細胞(包括中性粒細胞、 巨噬細胞等)，它們介導并放大了級聯樣的促炎反應，決定著ANP的嚴重程度[14]。研究顯示，在ANP病程的不同時期，通過促進或抑制中性粒細胞及CD4+T細胞的凋亡，可減輕早期ANP炎性應答，緩解ANP癥狀[15-16]。本研究結果顯示，Ad-FGL2-siRNA顯著下調了促炎癥細胞因子TNF-α和IL-1β水平，這對阻止局部組織損傷發展為系統炎癥反應起到了關鍵作用[9]，促炎細胞因子的下調也與上述胰腺病理學損傷的緩解相一致。本研究結果還顯示，Ad-FGL2-siRNA在ANP早期抑制了腺泡細胞的凋亡，這與上述沉默FGL2可抑制其他系統疾病的細胞凋亡結論相一致[2]。綜上所述，FGL2可能參與了小鼠ANP的發生發展，沉默FGL2基因表達，可抑制炎癥細胞的聚集和浸潤，抑制腺泡細胞的凋亡，從而對ANP早期起到一種保護作用。