高原低氧環(huán)境下大鼠急性壞死性胰腺炎相關(guān)性肺損傷p38MAPK的表達(dá)

韓彥舟 朱海宏 郭亞民

重癥急性胰腺炎(SAP)患者常伴有不可控制的全身炎癥反應(yīng)以及多器官功能障礙，其中以急性肺損傷最為突出，超過(guò) 50%的SAP 患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥，稱為SAP相關(guān)性肺損傷(SAP associated lung injury,SAP-ALI)，為SAP患者病死率高的主要原因[1-2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)屬于MAPK家族中應(yīng)激活化的蛋白激酶，主要介導(dǎo)應(yīng)激、炎癥等信號(hào)，在機(jī)體炎癥反應(yīng)調(diào)控過(guò)程中起著極其重要作用。有研究報(bào)道p38MAPK活化及過(guò)度表達(dá)可能是導(dǎo)致SAP-ALI的重要因素[3]。高原地區(qū)缺氧、低氣壓、紫外線強(qiáng)，更增加了SAP患者許多不確定因素[4]。本研究觀察不同海拔及不同時(shí)間點(diǎn)牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠p38MAPK表達(dá)變化及其與SAP-ALI的關(guān)系，為高原低氧環(huán)境下SAP-ALI的診療提供參考。

一、材料與方法

1．動(dòng)物分組及模型制備：SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠320只，3～4月齡，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK2004-0006)。大鼠以專用飼料喂養(yǎng)(北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供)，自由攝食和飲水。按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成西安組(海拔400米)、西寧組(海拔2 300米)、興海組(海拔3 300米)、溫泉組(海拔4 500米)，每組80只。適應(yīng)性飼養(yǎng)20 d后再隨機(jī)分為假手術(shù)組及ANP 1、6、12、24 h組，每組16只。采用胰頭、胰體以及胰尾部多點(diǎn)緩慢注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg體重方法建立大鼠ANP模型。假手術(shù)組打開(kāi)腹腔翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹。假手術(shù)組于造模后6 h處死，其他各時(shí)間組分別在造模后1、6、12、24 h處死[5]，取胰腺及肺組織，液氮冷凍后置-80℃保存。

2．胰腺、肺組織p38MAPK mRNA表達(dá)檢測(cè)：取凍存的胰腺及肺組織各100 mg，應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA，再以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。p38MAPK正義引物序列為5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，反義引物序列為5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；內(nèi)參β-actin正義引物序列為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義引物序列為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

3．胰腺、肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)檢測(cè)：取凍存的胰腺及肺組織各100 mg，應(yīng)用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p38MAPK蛋白，以β-actin為內(nèi)參。兔抗大鼠磷酸化p38MAPK一抗工作濃度為1∶80，ECL液顯影。應(yīng)用Image J軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

二、結(jié)果

1．各組大鼠胰腺、肺組織p38MAPK mRNA表達(dá)量比較：在相同海拔下，胰腺及肺組織p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量隨造模時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加，且各時(shí)間點(diǎn)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；除假手術(shù)組外，不同海拔條件下大鼠胰腺及肺組織p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)量隨海拔的升高而顯著增加，且各時(shí)間點(diǎn)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

2．各組大鼠胰腺、肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)量比較：在相同海拔下，胰腺及肺組織中p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，且各時(shí)間點(diǎn)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；除假手術(shù)組外，不同海拔條件下各組大鼠胰腺及肺組織p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量隨海拔的升高而顯著增加，且各時(shí)間點(diǎn)組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2，圖1)。

討論高原氣候的主要特點(diǎn)是低氣壓、低氧分壓、寒冷、干旱、多風(fēng)、輻射強(qiáng)和溫差大，大氣壓和氧分壓隨著海拔高度的增加而逐級(jí)降低[6]。在這種惡劣的環(huán)境條件下，一旦發(fā)生胰腺炎，由于肺臟對(duì)血氧含量變化特別敏感，更容易引起肺損傷的發(fā)生[7]。高原環(huán)境下出現(xiàn)低氧血癥、呼吸窘迫、肺毛細(xì)血管通透性改變等是高原地區(qū)AP患者肺損傷共同的病理生理基礎(chǔ)和臨床特征[8]，因此明確SAP-LI的發(fā)病機(jī)制迫在眉睫。

表1 各組大鼠胰腺組織、肺組織p38MAPK mRNA的表達(dá)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與同海拔1 h組比較，bP<0.05；與同海拔6 h組比較，cP<0.05；與同海拔12 h組比較，dP<0.05

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織p38MAPK蛋白的表達(dá)

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05;與同海拔1 h組比較,bP<0.05；與同海拔6 h組比較,cP<0.05;與同海拔12 h組比較,dP<0.05

圖1 西安組(1)、西寧組(2)、興海組(3)、溫泉組(4) ANP 1 h大鼠胰腺(上)、肺組織(下)p38MAPK蛋白的表達(dá)

MAPK包括4種亞型，其中p38MAPK是1993年Brester等發(fā)現(xiàn)的由360個(gè)氨基酸組成的蛋白，在機(jī)體應(yīng)激、缺氧、炎癥反應(yīng)調(diào)控過(guò)程中具有極其重要的作用[9]，被認(rèn)為是多條信號(hào)途徑的交匯點(diǎn)和共同通道。研究發(fā)現(xiàn)SAP引發(fā)的成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)及多器官組織功能障礙等并發(fā)癥的發(fā)生與多種細(xì)胞因子及炎性遞質(zhì)的作用有關(guān)[10]。劉君等[11]發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與SAP-ALI有著密切的關(guān)系；Werner等[12]研究證明，SAP-ALI與肺組織內(nèi)大量中性粒細(xì)胞積聚、活化、產(chǎn)生大量的促炎因子有關(guān)，活化的中性粒細(xì)胞在介導(dǎo)AP肺損傷中起關(guān)健作用；Chen等[13]研究表明，抑制ANP大鼠p38 MAPK的活化，可減少其炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β釋放，從而改善ANP的炎癥反應(yīng)，降低SAP-ALI發(fā)生率。

本研究結(jié)果顯示，造模后ANP可引起大鼠急性肺損傷，同時(shí)伴有p38MAPK活性及基因表達(dá)水平顯著增加，且其增加與海拔的升高呈正相關(guān)，這種變化貫穿于SAP-ALI發(fā)病的整個(gè)過(guò)程，表明p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)SAP-ALI的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。