狼瘡方調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞趨化因子表達(dá)的研究*

★ 王瑩 楊小軍 楊軍平（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，自身免疫性疾病形成的免疫復(fù)合物，沉積在腎小球，促進(jìn)腎組織細(xì)胞活化，引起大量細(xì)胞因子產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能異常，是公認(rèn)的狼瘡性腎炎（LN）產(chǎn)生的病理原因，是LN發(fā)病進(jìn)程的主要機(jī)制［1-2］。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）引起腎損害的病理變化部位主要在腎小球系膜區(qū)，具有趨化作用的細(xì)胞因子在腎小球球硬化的發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。中醫(yī)認(rèn)為狼瘡性腎炎先天稟賦不足，肝腎虧虛，或七情內(nèi)傷，郁久化熱，陰陽(yáng)失調(diào)，經(jīng)脈痹阻，營(yíng)衛(wèi)不和，衛(wèi)外不固，臟腑虧損而成；或因暴曬日光，內(nèi)外結(jié)合，兩熱相搏，導(dǎo)致氣血逆亂；或房事不節(jié)，傷及腎精，外感毒邪，復(fù)感濕邪之毒侵襲；或服食毒熱之品，導(dǎo)致致氣血不暢，阻滯經(jīng)絡(luò)血脈，邪毒久稽，傷陰血，浸淫筋骨臟腑，損害腎臟而致。在臨床實(shí)踐中，根據(jù)解毒活血法組成的狼瘡方是葉任高教授SLE病證結(jié)合治療方案中專用的中藥復(fù)方，其臨床療效得到廣泛認(rèn)可［3］。以葉任高狼瘡方為基本方，藥用全蝎、烏梢蛇、白花蛇舌草、紫草根、半枝蓮、野菊花等，調(diào)和諸藥，共奏滋因扶正，清熱解毒之功。HMC所表達(dá)的趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11，通過(guò)中藥干預(yù)的信號(hào)傳導(dǎo)通路如何，以及調(diào)節(jié)的機(jī)制尚不清楚。故本課題以HMC為研究對(duì)象，探討中藥作用在HMC表達(dá)趨化因子的狀況，并進(jìn)一步探討其具體機(jī)制，為中藥治療SLE提供可能的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）；胰蛋白酶（美國(guó)sigma）；胎牛血清 （美國(guó)Gibco）；重組人IFN-Y（美國(guó)Peprotech公司）；R-T PCR檢測(cè)試劑盒（ 上海Promega公司）；CXCL9/10/11上、下游引物（上海英濰捷基）；人CXCL9/10/11 酶聯(lián)免疫試劑盒（上海西塘公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTEK公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司）。狼瘡方由全蝎、烏梢蛇、白花蛇舌草、紫草根、半枝蓮、野菊花等中藥組成，常規(guī)水煎，分別濃縮成含生藥量0.3g/mL、0.6g/mL、1.2g/mL三種劑量，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Real-Time PCR檢測(cè)趨化因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量 人腎小球系膜細(xì)胞（中南大學(xué)細(xì)胞庫(kù)）用含10%的胎牛血清1640培養(yǎng)液，在37℃、置5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換液1次。依據(jù)作用于HMC的不同，分成5組：空白對(duì)照組：無(wú)任何藥物刺激，只加入完全培養(yǎng)液；刺激組：加入1000U/mL的IFN-Y刺激誘導(dǎo)HMC30min；中藥低劑量組加入含生藥量0.3g/mL中藥狼瘡方含培養(yǎng)液100μL預(yù)處理40min，再加入1000U/mLIFN-Y刺激誘導(dǎo)細(xì)胞30min。中藥中劑量組加入含生藥量0.6g/mL中藥狼瘡方含培養(yǎng)液100μL預(yù)處理40min，再加入1000U/mL IFN-Y刺激誘導(dǎo)細(xì)胞30min。中藥高劑量組加入含生藥量1.2g/mL中藥狼瘡方含培養(yǎng)液100μL預(yù)處理40min，再加入1000U/mL IFN-Y刺激誘導(dǎo)細(xì)胞30min。HMC經(jīng)過(guò)提取總RNA，分析總RNA的濃度及純度，達(dá)到純度標(biāo)準(zhǔn)，以GAPDH作為管家基因，CXCL9、CXCL10、CXCL11作為目的基因，引物CXCL9 5'-GAAGCAGCCAAGTCGGTTAGTG-3'、CXCL10 5'-TTAGTGGATGTTCTGACCCTGCTTC-3'、CXCL11 5'-CCATCGGAGTTTACAAAGTGCT-3'、GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，依據(jù)目的基因CXCL9、CXCL10、CXCL11PCR的反應(yīng)信號(hào)以及管家基因GAPDH的PCR反應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，算出熒光定量CT值，用2-AACT方法，計(jì)算樣本趨化因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量。AACT計(jì)算方法為：AACT=實(shí)驗(yàn)組（目的基因CT值-管家基因CT值）-空白組（目的基因CT值-管家基因CT值）。

1.3 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)趨化因子蛋白分泌量 獲取5組HMC 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液用細(xì)胞離心機(jī)12000xg，離心5min，去除沉淀，置于-80℃冷凍冰箱中保存，切勿反復(fù)凍融。ELISA檢測(cè)趨化因子濃度測(cè)定，在酶標(biāo)儀上，450nm處讀取吸光值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算各樣品對(duì)應(yīng)的CXCL9、CXCL10、CXCL11濃度，并通過(guò)ELISA軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩組比較采用雙側(cè) t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 狼瘡方調(diào)節(jié)IFN-Y介導(dǎo)的HMC的CXCL9mRNA、CXCL10mRNA和CXCL11mRNA的表達(dá) 刺激組CXCL9mRNA、CXCL10mRNA、CXCL11mRNA 相 對(duì)表達(dá)量明顯升高，與空白組對(duì)比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。給予中藥調(diào)節(jié)后，與刺激組比較，中藥各組有不同程度的降低，其中中藥中劑量組降低有顯著性（P＜0.01）。說(shuō)明狼瘡方可以調(diào)節(jié)趨化因子的信使RNA的表達(dá)。

表1 趨化因子mRNA相對(duì)表達(dá)量及中藥調(diào)節(jié)（）

表1 趨化因子mRNA相對(duì)表達(dá)量及中藥調(diào)節(jié)（）

注：與空白組相比*P＜0.01；與刺激組相比#P＜0.01。

組別 CXCL9mRNA CXCL10mRNA CXCL11mRNA空白組 1.00 1.00 1.00刺激組 107.81±10.92*1523.31±105.61*810.12±148.13*中藥低劑量組 93.48±14.11 1385.13±99.89 793.55±110.97中藥中劑量組 61.73±23.45# 811.36±60.99# 355.71±45.87#中藥高劑量組 94.16±13.77 1427.93±100.58 801.39±10.75

2.2 狼瘡方調(diào)節(jié)IFN-Y介導(dǎo)的HMC的CXCL9、CXCL10和CXCL11蛋白分泌量的變化 刺激組趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11蛋白分泌量明顯升高，與空白組對(duì)比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。給予中藥調(diào)節(jié)后，與刺激組比較，中藥各組有不同程度的降低，其中中藥中劑量組降低有顯著性（P＜0.01）。說(shuō)明狼瘡方可以調(diào)節(jié)趨化因子的蛋白分泌量的表達(dá)。

表2 趨化因子蛋白分泌量（pg/mL）及中藥調(diào)節(jié)（）

表2 趨化因子蛋白分泌量（pg/mL）及中藥調(diào)節(jié)（）

注：與空白組相比*P＜0.01；與刺激組相比#P＜0.01。

組別 CXCL9 CXCL10 CXCL11空白組 4.23±0.45 18.72±3.55 12.70±3.87刺激組 565.24±20.39*14323.78±3657.13 1301.11±38.48*中藥低劑量組 499.48±37.38 13996.27±3710.72 1299.45±40.21中藥中劑量組 243.39±11.67#8698.47±1796.63# 624.03±48.99#中藥高劑量組 501.47±30.72 14012.74±3589.62 1293.81±37.56

3 討論

趨化因子是小分子分泌蛋白，能激活免疫細(xì)胞的活性，介導(dǎo)細(xì)胞定向遷移、并參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)［4-5］，細(xì)胞趨化因子 CXCL9、CXCL10、CXCL11激活免疫細(xì)胞，并趨化至腎組織，介導(dǎo)Th1細(xì)胞、IFN-Y、腫瘤壞死因子（TNF-α）等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并進(jìn)一步加強(qiáng)人腎小球系膜細(xì)胞的增殖，加重狼瘡性腎炎的病理表現(xiàn)［6］。有學(xué)者報(bào)道［7］，很多細(xì)胞因子如IFN-Y、TNF-α等可誘導(dǎo)CXCL9、CXCL10、CXCL11的表達(dá)，但是IFN-Y的誘導(dǎo)效果最明顯。我們的課題通過(guò)IFN-Y誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞上趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在的表達(dá)，并用中藥加以干預(yù)調(diào)節(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在體外培養(yǎng)的HMC中，加以IFN-Y進(jìn)行誘導(dǎo)，趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表達(dá)增高，中藥狼瘡方可不同程度的調(diào)節(jié)趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表達(dá)，與刺激組相比，中藥中劑量組的趨化因子的表達(dá)顯著性下降（P＜0.01）。原因可能為，Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要有IL-2、IFN-Y、TNF-α，其中IFN-Y是最為重要的細(xì)胞因子，其在狼瘡性腎炎中扮演著重要作用，Th1細(xì)胞在 CXCL9、CXCL10、CXCL11的趨化作用下，大量的免疫細(xì)胞被活化，Th1輔助T細(xì)胞募集至腎小球，同時(shí)分泌IFN-Y和TNF-α，分泌的IFN-Y 與TNF-α又再次刺激趨化因子的表達(dá)，形成了一個(gè)放大的正反饋回路，加劇腎小球硬化，使得腎臟損害加重［8-9］，而狼瘡方抑制了Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和輔助T細(xì)胞的募集，減少I(mǎi)FN-Y的刺激，降低趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表達(dá)，延緩了腎小球的硬化和腎臟的損害。

我們通過(guò)體外培養(yǎng)HMC，檢測(cè)上清液中趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11 mRNA的表達(dá)及其蛋白分泌量水平的變化，加之以中藥進(jìn)行干預(yù)，說(shuō)明中藥狼瘡方能調(diào)節(jié)趨化因子CXCL9、CXCL10和CXCL11在人腎小球系膜細(xì)胞上的表達(dá)，抑制趨化因子蛋白的分泌，對(duì)評(píng)估SLE腎臟損害程度、病情變化狀況以及預(yù)后具有一定的價(jià)值，為中藥治療SLE提供可能的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。