殼寡糖-槲皮素聚合物的制備及體外抗人子宮內膜癌作用的研究

吳 愚，林佳穎，王未來，劉正蕓，勾 英，張能英，羅 果，王 歡

子宮內膜癌是高發的女性惡性腫瘤之一,其致病因素不明,絕經后女性的發病率較高[1]。早期患者以手術治療為主,晚期患者采用手術、放療和化療相結合的綜合治療手段。手術治療不但復發轉移率高,且對于年輕的患者而言,手術切除會降低雌激素,引起絕經期癥狀。雖然化療有一定的療效,但由于化療的副作用明顯,很少單獨應用于子宮內膜癌的治療[2]。所以對于子宮內膜癌,目前亟待全新的藥物與治療方法。

槲皮素是植物界分布廣泛的多酚類化合物[3]。研究表明,槲皮素抑制腫瘤生長及誘導腫瘤細胞凋亡的作用,與它能夠清除氧自由基、抑制癌基因表達、阻止癌細胞的擴散有關[4-8],而且槲皮素還能在誘導腫瘤細胞凋亡的同時,減少活性氧自由基的生成,保護正常細胞[9-10]。由于槲皮素難溶于水,吸收困難,所以眾多研究者對其結構進行修飾,以改善槲皮素的溶解性而以利于腫瘤治療[11-12]。殼寡糖是殼聚糖通過降解而形成良好的水溶性產物。殼寡糖含有多種活性官能團[13],能與腫瘤細胞表面的受體連接,打開腫瘤細胞膜,有效運載藥物,發揮抗腫瘤作用[14-15]。

本研究通過改善槲皮素的結構,合成殼寡糖-槲皮素聚合物,研究該聚合物的溶解度及其在體外對子宮內膜癌細胞的抗腫瘤作用,為該聚合物用于子宮內膜癌的治療提供實驗數據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人子宮內膜癌細胞(JEC)、人正常肝細胞(LO2),本實驗室保存。

1.1.2 試劑 殼寡糖由大連中科格萊科生物公司(依托中國科學院大連化學物理研究所)惠贈；槲皮素(用無水乙醇配制成終濃度0.001 mg/mL)購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、50%戊二醛(用去離子水配制成終濃度1%)均購自成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 儀器 電子掃描顯微鏡(德國Carl Zeiss Jena公司)；紅外光譜儀(德國Bruker Optics公司)；紫外光譜儀(美國Thermo公司)；酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備殼寡糖-槲皮素聚合物 聚合物制備流程見圖1。

圖1 殼寡糖-槲皮素聚合物制備流程圖

1.2.2 殼寡糖-槲皮素聚合物的鑒定

1.2.2.1 掃描電鏡觀察形貌 取制備的殼寡糖-槲皮素聚合物(簡稱聚合物)0.01 g,干燥后用導電性好的粘合劑粘在金屬樣品臺上,放在真空蒸發器中噴鍍一層50～300 A的金屬膜,在掃描電鏡下觀察,加速電壓5 kV。

1.2.2.2 紅外光譜儀分析 取制備的聚合物0.01 g,將其溶解后,制成KBr窗片,用紅外光譜儀掃描。

1.2.2.3 紫外光譜儀分析 取制備的聚合物按1∶4的體積溶于去離子水中,取4 mL液體加入比色杯中,進行紫外光譜分析。

1.2.3 聚合物實驗溶解性分析 稱量槲皮素0.05 g配成3.33 mg/mL的槲皮素乙醇溶液,并取5 mL的3.33 mg/mL槲皮素乙醇溶液加入5 mL去離子水定容,再與去離子水混合,配制成17.75 mg/L、35.50 mg/L、71.00 mg/L、142.00 mg/L、284.00 mg/L,去離子水為空白對照,依次取0.1 mL加入96孔板中,得槲皮素系列質量濃度標準溶液。在373 nm波長處測定一系列溶液的吸光度,并對槲皮素質量濃度進行線性回歸,得到方程y＝0.0067x+0.1284(R2＝0.995,x為溶液濃度,y為吸光度)。

取1 mL槲皮素乙醇溶液(3.33 mg/mL)與5 mL去離子水混合,不斷加入1 mL去離子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結果,代入標準曲線方程求出槲皮素的表觀溶解濃度。

取0.017 mg/mL殼寡糖20 mL與0.001 mg/mL槲皮素5 mL混合,不斷加入1 mL去離子水,直到槲皮素析出,取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結果,代入標準曲線方程求出表觀溶解度。

取聚合物固體加入1 mL去離子水中,再逐漸加入聚合物固體,直至飽和狀態。每組取0.1 mL加入96孔板,373 nm波長下測出吸光度,測量3次結果,代入標準曲線方程求出表觀溶解度。

1.2.4 JEC和LO2細胞的培養 將JEC及LO2細胞置于37℃、5%CO2培養箱中培養,培養液為RPMI1640(含10%胎牛血清),用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.5 聚合物對腫瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響

1.2.5.1 單獨用藥組 分為陰性對照組、陽性藥物(順鉑)對照組以及聚合物組。藥物濃度分別為3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和16.67 mg/L。

1.2.5.2 聯合用藥組 分組如下：①陰性對照組；②聚合物作用2 h后聯用順鉑組(J+S)；③順鉑作用2 h后聯用聚合物組(S+J),用藥濃度為3.33 mg/L、6.67 mg/L、10.00 mg/L、13.33 mg/L 和 16.67 mg/L。增殖實驗采用四氮唑藍比色分析法(methythiazolyl-tetrazolium,MTT),在吸收波長490 nm下測定各組細胞的OD值,計算存活率(%)及抑制率(%),存活率(%)＝用藥組OD值/陰性對照組OD值,抑制率(%)＝1-存活率(%)。

1.2.6 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件進行分析,計量資料以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聚合物的鑒定 掃描電鏡分析顯示：單獨的殼寡糖為球狀(圖2A),單獨的槲皮素為方塊狀(圖2B),磁力攪拌合成的聚合物為不規則團塊狀(圖2C)。由此可判斷方塊狀的槲皮素被其它物體覆蓋,形成不規則的形狀。

圖2 掃描電鏡圖

紅外光譜儀掃描結果：在3 306.81～2 929.44 cm-1波數、1 632.71～1 028.26 cm-1波數出現苯環結構上的特有吸收峰位(圖3)。

圖3 殼寡糖-槲皮素聚合物紅外光譜圖

紫外光譜儀掃描結果：聚合物中槲皮素紫外特征吸收峰為363 nm(圖4A),而單獨的槲皮素紫外特征吸收峰為374 nm(圖4B)。它們的最大吸收波長相差11 nm,并且聚合物中的槲皮素發生藍移,說明產生新的物質。

圖4 紫外光譜圖

綜上結果,可得出殼寡糖已連接上槲皮素。

2.2 聚合物在水中溶解性測定結果 槲皮素在水中的表觀溶解度低于聚合物在水中的溶解度(P＜0.05),也低于殼寡糖與槲皮素混合物的溶解度(P＜0.05),表 1。

表1 槲皮素及殼寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

表1 槲皮素及殼寡糖-槲皮素混合液和聚合物在水中的溶解度(±s)

注：與槲皮素組比較,?P＜0.05

樣 品 表觀溶解度1 2 3平均值(±s)槲皮素 45.63 62.08 45.23 47.65±3.85殼寡糖-槲皮素混合溶液 173.14 144.93 163.79 160.62±14.37?殼寡糖-槲皮素聚合物 276.08 307.23 298.58 293.96±16.08?

2.3 聚合物對腫瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響 MTT結果顯示：聚合物各個濃度組,對JEC細胞的增殖均有抑制作用(P＜0.05),但毒性作用不及順鉑(圖5A)；順鉑對LO2細胞的增殖有明顯的抑制作用(P＜0.05),而各濃度組的聚合物對LO2細胞均無抑制作用(P＜0.05,圖5B)。

圖5 聚合物對正常細胞(LO2)和腫瘤細胞(JEC)增殖的影響(單獨用藥)

2.4 聚合物與順鉑的聯用順序對腫瘤細胞(JEC)和正常細胞(LO2)增殖的影響 MTT結果顯示,先加順鉑后加聚合物(S+J)除了在濃度為3.33 mg/L未能產生毒性作用(P＞0.05),其余濃度保持著抑制JEC細胞增殖的作用(P＜0.05),但此組未對LO2細胞產生毒性(P＝0.054,圖6A)；先加聚合物后加順鉑(J+S)保持著抑制JEC細胞增殖的作用(P＜0.05),還對LO2細胞增殖產生一定抑制作用(P＜0.05,圖 6B)。

圖6 聚合物對正常細胞(LO2)和腫瘤細胞(JEC)增殖的影響(聯合用藥)

3 討論

殼寡糖是具有抗真菌和病毒活性的聚糖衍生物[16],過往研究者多選取聚糖作為包封材料,但是聚糖分子量大,水溶性不及殼寡糖[17]。并且,選取聚糖用作包封物合成方法較為復雜,目的是形成糖-脂質-包裹物的脂質體[18]。而本研究采取簡化的磁力攪拌,形成糖-包裹物聚合物,以庫倫力、氫鍵及羥醛縮合的三層動力,達到殼寡糖包裹槲皮素的目的。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物,它能調控細胞信號通路,誘導腫瘤細胞周期停滯,促進凋亡,抑制腫瘤細胞內耐藥基因編碼的糖蛋白表達及其活性,逆轉腫瘤細胞的耐藥作用[19]。本研究通過掃描電鏡下表征、紅外光譜儀測量、紫外光譜儀測量及溶解性分析,不僅證明得到目標聚合物,而且目標聚合物有良好的親水性。

MTT法測定聚合物對細胞增殖的影響,聚合物單獨使用時,各個濃度組均對JEC細胞產生抑制作用。用于LO2細胞時,在一定濃度下,表現出對LO2細胞的生長促進作用。原因可能是高濃度的聚合物以團聚的方式,造成殼寡糖包裹層過厚,細胞在胞吞聚合物時,釋放槲皮素比較緩慢。聯合用藥時,先加順鉑后加聚合物、先加聚合物后加順鉑組對JEC及LO2的毒性都低于順鉑單獨用藥組,先加順鉑后加聚合物時,順鉑對JEC和LO2細胞產生抑制作用,后加入的聚合物對順鉑產生干擾作用,可能是聚合物中槲皮素的部分基團與順鉑中的金屬絡合物發生化學反應,致使抑制JEC的作用低于單獨應用的順鉑效果,也導致對LO2細胞未產生明顯的抑制作用。先加聚合物后加順鉑時,聚合物雖然能起到抑制JEC生長和促進LO2細胞生長,阻擋一部分順鉑接觸細胞,屏蔽順鉑發揮過強的毒性作用,但是這也導致對JEC抑制率降低,而未被細胞吞噬的聚合物,又不能完全釋放槲皮素與順鉑發生反應,導致部分順鉑進入正常細胞,發揮對LO2細胞的抑制作用。

未來,通過包裹材料運載藥物抗腫瘤治療將會成為醫學科研的重點發展方向。包裹聚合物的尺度也將不斷從分子化縮小為納米化,并且靈敏度和準確度也會提高,腫瘤的治療效果及患者的生存質量將會得到改善。本研究初步完成分子化尺度的運載藥物,證明目標聚合物抗腫瘤真實有效,后續將以縮小尺度為目標,繼續深入研究。