正交設計優化低溫應激誘導IEC-6細胞損傷條件的實驗研究

熊 鳴，張達矜，喬媛媛，史成和

體溫過低癥是一種嚴重的臨床綜合征,中重度體溫過低癥的死亡率極高,病死率甚至高于心肌梗死和感染性休克,但其救治困難的機制尚不十分清楚[1]。低溫是體溫過低癥最根本的致傷因素。多項動物和細胞實驗證實低溫可直接誘導組織損傷和細胞死亡。已有研究提示,腸上皮細胞功能、結構受損在低溫臟器損害的發生發展中可能具有極其重要的作用[2]。本研究擬在前期工作基礎上,通過正交設計優化低溫應激誘導大鼠小腸隱窩上皮(intestinal epithelial crypt,IEC-6)細胞損傷條件,建立較為穩定的低溫應激細胞損傷實驗模型,為后續的低溫應激損傷與繼發性損傷機制以及救治研究奠定細胞學實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠IEC-6細胞株由中國醫學科學院基礎所細胞中心提供。高糖DMEM培養基和胎牛血清為美國Gibco公司產品；細胞增殖/毒性檢測試劑(cell counting kit-8,CCK-8)為日本同仁化學研究所產品；細胞凋亡檢測試劑AnnexinⅤ-PE/7-AAD Kit和線粒體膜電位檢測試劑JC-1 Kit為美國BD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞接種于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養基,置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。每2～3天傳代1次。

1.2.2 細胞低溫處理方法 將生長良好的IEC-6細胞置于密閉細胞培養小室(billups-rothenberg產品,MIC-101型),設定通氣條件為95%空氣+5%CO2預混合氣體,以20 L/min流量持續通氣8 min,置于設定溫度條件有機箱中。

1.2.3 正交實驗設計 根據預實驗結果,在50%＜細胞存活率＜90%范圍內采用正交實驗設計進一步優化處理條件。以溫度、處理時間和接種密度為正交優化的3個因素,每個因素設定3個水平,分別為處理溫度(4℃,10℃,22℃),低溫處理時間(2 h,4 h,6 h),接種密度(1×105/mL,2.5×105/mL,5×105/mL),根據三因素三水平設計正交實驗表,得到9個實驗組,每組設5個復孔。CCK-8法分析細胞毒性,在50%＜細胞存活率＜90%范圍內獲得最優組合條件。隨后,實驗組IEC-6細胞以最優組合條件進行處理,同時設置正常對照組,鏡下觀察細胞形態,流式細胞術檢測細胞凋亡和線粒體膜電位。

1.2.4 CCK-8法分析細胞毒性 取對數生長期IEC-6細胞,調整細胞密度,接種于96孔板中(每孔100 μL),于37 ℃、5%CO2培養箱中孵育12 h后更換培養基。根據實驗分組,實驗組置于細胞培養小室(通氣條件為95%空氣+5%CO2),分別于設定低溫(4℃,10℃,22℃)環境條件下培養設定處理時間(2 h,4 h,6 h)。正常對照組置于37℃、5%CO2培養箱正常培養,同時設置空白對照。處理結束后加入CCK-8試劑,37℃繼續培養2 h,酶標儀測定450 nm吸光度(A)。按公式計算細胞存活率：細胞存活率(%)＝[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。(1-細胞存活率)即代表細胞毒性。1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡和線粒體膜電位取對數生長期IEC-6細胞,按最優組合條件調整細胞密度,接種于10 cm2培養皿中(每皿3 mL),于37℃、5%CO2培養箱中孵育12 h后更換培養基。根據實驗分組,實驗組置于細胞培養小室(通氣條件為95%空氣+5%CO2),于設定溫度環境條件下培養設定處理時間,正常對照組置于37℃、5%CO2培養箱正常培養。

收集各組細胞和培養上清,調整密度至5×105/mL,分別進行如下處理：①按照AnnexinⅤ-PE/7-AAD Kit說明書檢測細胞凋亡。流程簡述如下：取上述細胞懸液1 mL,400 g離心5 min,去上清液,4℃預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次,加入0.5 mL結合緩沖液重懸,加入5 μL AnnexinⅤ-PE抗體,輕輕混勻,室溫避光孵育15 min后,加入5 μL7-AAD,輕輕混勻后上機檢測。②按照JC-1 Kit說明書檢測線粒體膜電位。流程簡述如下：取上述細胞懸液1 mL,400 g離心5 min,去上清液,加入0.5 mL新鮮配置的JC-1工作液,輕輕混勻,37℃、5%CO2培養箱中孵育15 min,加入1×分析緩沖液洗滌2次,加入0.5 mL 1×分析緩沖液重懸,輕輕混勻后上機檢測。當細胞線粒體膜電位正常時,JC-1主要以聚合體形式存在,FL-2通道上顯示為高強度紅色熒光信號；當膜電位發生去極化時,JC-1則主要以單體形式存在,FL-2通道上紅色熒光信號減弱,細胞群發生偏移。通過CellQuest軟件分析強弱紅色熒光信號細胞比例,相對定量線粒體膜電位水平。實驗重復3次,結果取平均值。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計學軟件和正交設計助手ⅡV3.1專業版軟件,設計三因素三水平正交表,通過極差法確定主效應因素。應用CellQuest軟件分析流式細胞結果,數據采用均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正交優化實驗結果 通過正交實驗設計優化低溫應激誘導IEC-6細胞損傷的條件,按三因素三水平設計正交實驗表進行實驗(表1)。根據R值大小可知,在50%＜細胞存活率＜90%范圍內,3個因素對細胞毒性的影響程度為：處理溫度＞低溫處理時間＞接種密度。通過K值分析上述范圍內3個因素各水平對細胞毒性的影響程度為：處理溫度：4℃＞10℃＞22 ℃,接種密度：5×105/mL＞1×105/mL＞2.5×105/mL,低溫處理時間：4 h＞6 h＞2 h。 因此在50%＜細胞存活率＜90%范圍內,低溫應激誘導IEC-6細胞損傷的最優組合條件為：處理溫度4℃,接種密度5×105/mL,低溫處理時間4 h。

表1 三因素三水平設計正交實驗表正交優化實驗結果

2.2 最優組合條件下IEC-6細胞形態 對數生長期IEC-6細胞以5×105/mL密度接種于10 cm2培養皿中(每皿3 mL),正常培養條件下孵育12 h后更換培養基,實驗組細胞置于4℃處理4 h,鏡下觀察細胞形態變化。結果如圖1所示：正常IEC-6細胞為不規則多角形,邊界清楚,細胞核較大,呈卵圓形,細胞間相互連接,呈鋪路石鑲嵌排列,互不重疊。而實驗組細胞胞體收縮變小,邊緣模糊呈扁平狀,胞漿內可見黑色顆粒狀物,折光性降低,細胞核大小不一,形態不規則。

圖1 鏡下細胞形態

2.3 最優組合條件下IEC-6細胞凋亡和線粒體膜電位 實驗組細胞置于4℃處理4 h后,細胞凋亡情況如圖2A所示：與對照組相比,實驗組細胞凋亡明顯加重。前者以早期凋亡為主,細胞凋亡率為(4.41±1.36)%,后者則以中晚期凋亡和壞死為主,細胞凋亡率為(23.70±2.94)%,2者比較差異有統計學意義(F＝14.56,P＜0.01)。

線粒體膜電位變化如圖2B所示：與對照組相比,實驗組細胞群發生明顯偏移,表現為FL-2通道紅色熒光信號減弱,低強度紅色熒光細胞(R2)比例顯著增高,(31.12±3.66)%vs(5.24±0.57)%(F＝23.80,P＜0.01)。說明線粒體膜電位去極化增強,與之伴隨的細胞凋亡亦加重,結果與前者一致。

圖2 細胞凋亡和線粒體膜電位

3 討論

體溫過低癥是指各種原因引起的中心體溫低于35℃時的狀態[3]。研究表明,體溫過低癥能引起機體多個生理系統功能失調,包括微循環改變和組織氧供減少,最終導致以嚴重休克、水電解質紊亂和凝血障礙為突出表現的多器官功能障礙綜合征(multiorgan dysfunction syndrome,MODS)[4-5]。隨著社會的發展,潛水、航海、高寒地區作業及登山等活動相應增加,體溫過低癥發生率呈逐年上升趨勢。然而,目前對于體溫過低癥病理過程中,導致組織和細胞損傷的機制尚不清楚,因此缺乏特殊有效的臨床救治措施,這也是中重度體溫過低癥患者高死亡率的重要原因[6-7]。

低溫是體溫過低癥最根本的致傷因素。多項動物和細胞實驗證實低溫可直接誘導組織損傷和細胞死亡。根據低溫程度不同,細胞可激活凋亡信號或直接壞死。低溫引起的凍結性損傷主要通過生物膜結構和形態異常、膜的生理功能紊亂等導致細胞膜破裂,細胞崩解壞死；而在非凍結性損傷時,主要通過激活細胞凋亡信號,誘導細胞凋亡[8-9]。在各種原因引起MODS的發生中,腸道既是受損的“靶”器官,又是損傷的“激發”器官[10-11]。近年來研究發現腸上皮細胞功能、結構受損在低溫臟器損害的發生發展中具有極其重要的作用,是導致重度體溫過低癥MODS的重要原因[12-13]。然而,目前對于腸上皮細胞凋亡在體溫過低癥病理生理過程中的的具體作用,針對低溫尤其低溫引起的繼發性損傷的機制尚不清楚[14-15]。本研究以大鼠IEC-6細胞為研究對象,采用正交實驗設計優化低溫應激誘導IEC-6細胞損傷的條件,建立較為穩定的腸上皮細胞低溫應激損傷模型,為后續的機制研究奠定基礎。

正交實驗設計是利用正交表科學的安排與分析多因素實驗的方法,是科研中當需要考慮多因素、多水平對實驗結果的影響時優先選用的實驗分析方法；具有高效、快速、靈活、均勻分散及整齊可比的特點；通過極差R值來反應各優化因素對結果影響的程度,極差R值越大,影響程度越大。為后續進一步干預處理,本研究將細胞損傷程度設定在50%＜細胞存活率＜90%范圍內,通過正交實驗設計獲得該范圍內低溫應激誘導IEC-6細胞損傷的最優組合條件為：處理溫度4℃,接種密度5×105/mL,低溫處理時間4 h。進一步評價最優組合條件下IEC-6細胞損傷情況：光學顯微鏡顯示細胞形態,細胞凋亡率和線粒體膜電位檢測相結合顯示細胞凋亡。結果表明：與對照組相比,最優組合條件下實驗組細胞失去正常形態,同時線粒體膜電位去極化增強,細胞凋亡顯著加重。符合低溫應激誘導細胞損傷特點,為后續低溫致傷機制研究奠定實驗基礎。