重組截短型TGF—β前體潛在相關肽的原核表達及其對HSC—T6細胞增殖的影響

石永萍 鄭俊雅 劉增瑞 李魯新 王晶 李玲玉 曹雅男 初彥輝

[摘要]目的 初步研究截短型TGF-β前體潛在相關肽（LAP）的重組蛋白對HSC-T6 細胞增殖的影響。方法 PCR擴增截短型LAP片段，構建該片段的原核表達載體，經雙酶切、DNA測序鑒定后，IPTG 0.5 mmol/L，37℃，4 h誘導出蛋白的大量表達，表達的蛋白經SDS-PAGE，Western blot檢測，經鎳瓊脂糖親和層析純化重組蛋白， 將重組蛋白作用于大鼠肝星狀細胞-T6（HSC-T6），用MTT法檢測不同濃度重組蛋白對細胞增殖作用的影響。結果 原核表達載體構建成功，成功表達、純化了重組蛋白，且HSC-T6細胞的增殖程度隨重組蛋白濃度的增加而降低。結論 重組蛋白可抑制HSC-T6細胞的增殖，為后續研究LAP片段對TGF-β活化過程的干擾作用及對器官纖維化的影響奠定基礎。

[關鍵詞]TGF-β前體潛在相關肽；原核表達；蛋白純化；HSC-T6；增殖

[中圖分類號] R331 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（b）-0004-04

Prokaryotic expression of latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor and its influence on proliferation of HSC-T6 cell

SHI Yong-ping1，2 ZHENG Jun-ya1 LIU Zeng-rui1 LI Lu-xin1 WANG Jing1 LI Ling-yu1 CAO Ya-nan1 CHU Yan-hui1

1.Medical Research Center，Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China；2.Inspection and Legal Affairs Section，Mudanjiang Public Health Inspection Institution，Heilongjiang Province，Mudanjiang 157011，China

[Abstract]Objective To preliminarily study the influence of recombinant protein of latency-associated peptide （LAP） of recombinant truncated TGF-β precursor on proliferation of hepatic stellate cells （HSC）-T6.Methods The truncated LAP fragment was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and the prokaryotic expression vector was constructed.After double enzyme digestion and DNA sequencing，the protein expression was induced by IPTG at 0.5 mmol/L at 37°C for 4 h.The expressed protein was detected by SDS-PAGE and Western blot，after that the recombinant protein was by nickel agarose affinity chromatography for purification.The recombinant protein was applied to rat hepatic stellate cell-T6 （HSC-T6），and the influence of different concentrations of recombinant protein on cell proliferation was detected by MTT assay.Results The prokaryotic expression vector was successfully constructed and the recombinant protein was expressed and purified successfully.The proliferation of HSC-T6 cells decreased with the increase of the recombinant protein concentration.Conclusion The recombinant protein inhibits the proliferation of HSC-T6 cells，and lays the foundation for the subsequent study on the interference of LAP fragments on the activation of TGF-β and the influence on organ fibrosis.

[Key words]Latency-associated peptide of recombinant truncated TGF-β precursor；Prokaryotic expression；Protein purification；Hepatic stellate cells-T6；Proliferation

轉化生長因子-β（TGF-β）具有多種生物學功能，促纖維化是其最重要的功能之一，被大多數學者公認為纖維化形成與發展的啟動樞紐[1-3]。TGF-β的活化過程是其發揮正常功能的關鍵步驟，是一個受多種因素影響的復雜過程，在纖維化性疾病的發生、發展中起重要作用[4-6]。TGF-β的活化在細胞外完成，是受多種因素影響的復雜過程。在胞內，TGF-β的各種異構體都是由各個獨立基因產生的，先是被合成前體蛋白，然后在內肽酶、Furin 酶作用下產生TGF-β蛋白N端的二聚體潛在相關肽（LAP）和C端的二聚體成熟型TGF-β，這兩部分以非共價形式相連，即TGF-β與LAP的復合物，它不具有生物活性[7-9]。LAP上的半胱氨酸富集區能夠結合TGF-β功能區，并且LAP上具有結合潛在TGF-β 結合蛋白（LTBP）和整合素的識別區域[10-11]，TGF-β與LAP的復合物被分泌到細胞外后，經過復雜的過程，并在LTBP、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP被祛除或發生構型改變，導致復合物瓦解，方可釋放具有生物活性的TGF-β，TGF-β通過與細胞膜表面特異性受體結合才能發揮生物學效應[12-15]。本實驗以人源LAP蛋白為研究對象，希望構建一種能與TGF-β高效結合的截短型LAP片段，即能高效地與野生型LAP競爭結合TGF-β，在TGF-β活化的起始階段干擾TGF-β的活化，進而抑制TGF-β信號傳導。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；RNA提取試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；PCR相關試劑購自日本東洋紡公司；XholⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶及Buffer購自寶生物工程大連有限公司；引物、非干擾型蛋白定量試劑盒、W-TMB顯色試劑盒均由上海生工生物工程股份有限公司產品。PCR儀，離心機，均為德國Eppendorf公司產品。

1.2 人源LAP截短型片段的擴增

依據Gene Bank數據庫中LAP的cDNA序列設計引物，為方便克隆在上下游引物的5′端加入XholⅠ和EcoRⅠ的酶切位點，上游引物5′-AGTGGACATCAACGGGTTC-3′，下游引物5′-CCAGTGTGTTATCCCTGCT-3′。按RNA提取試劑盒提人血總RNA，逆轉錄成cDNA，并以此為模板擴增基因片段。反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸5 min。

1.3 原核表達載體的構建

擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA回收試劑盒回收產物，回收的基因和載體pET28a分別用限制性內切酶XholⅠ、EcoRⅠ雙酶切。回收酶切產物后連接載體與基因片段，得到pET28a-LAP-B2重組質粒。將重組質粒轉化至感受態DH5α，將連接產物涂布于卡那霉素抗性的LB平板培養基上，烘箱37℃培養12 h。挑取單克隆菌落搖菌過夜，抽提質粒進行雙酶切鑒定，并將陽性克隆測序。

1.4 重組蛋白的原核表達

將測序正確的重組質粒轉化至感受態大腸埃希菌BL21，挑取單菌落于5 ml LB培養基中，37℃，220 r/min過夜培養。將過夜培養的菌液按1∶100比例分別接種于10 ml的LB培養基中，37℃，220rpm震蕩培養至OD值為0.6時，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min，分別20℃誘導過夜，37℃誘導4 h，未加IPTG組為陰性對照，選擇最佳的誘導條件。誘導后收集菌體用PBS緩沖液懸浮，超聲破碎菌體，離心分別收集上清和沉淀，沉淀用包涵體溶解液溶解，用12%的SDS-PAGE膠電泳檢測，電泳結束后用考馬斯亮藍染色。

1.5 重組蛋白的純化

按表達量最高的條件大量誘導表達重組蛋白后，用PBS將收集的菌體重懸，冰浴超聲破碎菌體，12 000 r/min，4℃，離心20 min，收集上清進行純化。用鎳瓊脂糖親和層析法純化，用20、50、500 mmol/L的咪唑梯度洗脫，將收集到的組分進行SDS-PAGE檢測，將純度最好的洗脫組分經透析膜透析2 h后再經濾膜過濾、分裝，-80℃保存。SDS-PAGE電泳和Western blot檢測純化后的蛋白，并使用SK3071非干擾型蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.6大鼠肝星狀細胞- T6（HSC-T6）的增殖檢測

MTT實驗設有正常對照組、模型組、重組蛋白作用組7組（5、10、25、50、75、100、200 ng/ml）、空白對照組，除正常對照組和空白組外，其他組均加入10 ng/ml的 TGF-β活化細胞。每組5個復孔，按每孔8×103細胞種至3個96孔板中，培養至貼壁后加入藥物，分別培養12、24、48 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT，培養4 h后棄培養液，加入150 μl DMSO震蕩10 min，用酶聯儀測試490 nm處吸光度值（OD）。

2 結果

2.1 LAP截短片段的擴增

人源LAP片段為747 bp，實驗設計的截短片段為171 bp，PCR擴增后，結果顯示產物條帶大小為171 bp，與實驗設計一致（圖1）。

2.2 原核表達載體鑒定

抽提陽性克隆菌液質粒，用XholI、EcoRI雙酶切， 酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，分別產生171 bp和5369 bp的條帶，與目的片段和載體大小相符（圖2）。陽性克隆重組質粒送于上海生工生物工程有限公司測序，測序結果表明插入的序列與Genebank公布的序列一致（圖3）。

2.3 重組蛋白的表達和純化

經IPTG誘導表達，發現重組蛋白以包涵體形式大量存在于37℃誘導4 h的菌體沉淀中（圖4），分子量大小為10.3 KD，與預期目的蛋白分子量一致，可進一步純化。將收集的菌體用破碎Buffer溶解（2 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1% Triton X-114，1 mmol/L DTT，pH 8.0），冰浴超聲破碎菌體，用鎳柱純化重組蛋白，利用咪唑梯度洗脫，收集洗脫液。SDS-PAGE檢查從包涵體中純化出了目的蛋白（圖5）。

重組蛋白經過純化，SDS-PAGE電泳分析在相應位置出現明顯條帶，表明重組蛋白成功得到了純化（圖6）。蛋白經Western blot檢測在相應位置出現明顯條帶（圖7），用W-TMB顯色試劑盒顯色，經測定蛋白濃度>85%。

2.4 MTT檢測細胞增殖結果

不同濃度的重組蛋白作用于HSC-T6細胞，不同時間測其OD490值，其OD490值均低于TGF-β活化組，并隨重組蛋白濃度加大，作用時間的延長，其OD490值逐漸降低，呈現時間-劑量依賴性（圖8）。

3討論

TGF-β具有廣泛的生物學功能，TGF-β的活化過程是其發揮正常功能的關鍵步驟，是一個受多種因素影響的復雜過程[16-17]。本試驗以TGF-β活化過程的相關蛋白LAP為研究對象，構建了LAP片段的原核表達載體，經IPTG誘導，重組蛋白在包涵體中大量表達，包涵體表達能在一定程度上保持表達產物的結構穩定[18-20]，并從包涵體中成功純化出目的蛋白，用Western blot確定了表達的特異性，并對蛋白的表達和純化條件進行了優化，經純化后獲得了純度>85%的重組蛋白。將重組蛋白作用于HSC-T6細胞，發現其顯著抑制了該細胞的增殖，這為后續研究人源LAP片段重組多肽對TGF-β活化過程的干擾，以及研究其對TGF-β生物學功能的影響提供有利的保障，并為纖維化疾病的研究和治療提供新思路。

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（收稿日期：2018-03-23 本文編輯：許俊琴）