棉花VIGS病毒載體的構(gòu)建及其在抗病基因功能鑒定的應(yīng)用

李建平，郝曉燕，李琴，高升旗，常曉春，陳勛基，足木熱木·吐?tīng)栠d，陳果，黃全生

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是植物抵抗病毒侵染的一種自然機(jī)制，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，VIGS具有快速、高效、高通量等優(yōu)點(diǎn)[1,3]。VIGS可廣泛用于大規(guī)模篩選，以鑒定感興趣的表型和基因序列的功能。隨著對(duì)VIGS載體的不斷了解和開(kāi)發(fā)，VIGS體系將會(huì)在更多寄主植物上建立，尤其是對(duì)于現(xiàn)有載體較難進(jìn)行基因功能研究的植物上，利用VIGS技術(shù)開(kāi)發(fā)新的沉默載體研究這些植物的功能基因。因此，VIGS將成為基因功能研究和植物功能基因組學(xué)研究的最有效工具,廣泛應(yīng)用于植物抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育以及代謝調(diào)控等生理途徑相關(guān)基因功能的研究[2,7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)作為目前公認(rèn)有效的基因功能研究手段，不僅不受基因種類的限制，而且在多個(gè)雙子葉植物中得到了應(yīng)用，已通過(guò)該技術(shù)在煙草、馬鈴薯及番茄等植物中發(fā)掘出多個(gè)與植物抗病反應(yīng)、代謝調(diào)控以及生長(zhǎng)發(fā)育等相關(guān)基因[4,6,7]，也在棉花抗病相關(guān)基因的發(fā)掘和基因功能研究中發(fā)揮了重要的作用。應(yīng)用該技術(shù)，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與棉花抗病相關(guān)的基因[8,9]。【本研究切入點(diǎn)】鈣依賴蛋白(CPK)基因家族成員參與了植物生物與非生物脅迫信號(hào)途徑的調(diào)控，在植物防御生物與非生物脅迫方面扮演了重要角色[10,11,12]。VIGS技術(shù)目前得到了廣泛應(yīng)用，該技術(shù)應(yīng)用在發(fā)掘與黃萎病相關(guān)基因方面取得了極大進(jìn)展[8, 9]。目前，尚未見(jiàn)陸地棉CPK基因家族參與棉花黃萎病抗病調(diào)控方面的研究報(bào)道。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS基因沉默技術(shù)。研究陸地棉抗病相關(guān)基因在棉花抗黃萎病中的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】構(gòu)建GhCPKVIGS基因沉默載體，應(yīng)用VIGS技術(shù)體系研究GhCPK基因家族在棉花抗病中的功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1為實(shí)驗(yàn)室自主保存；菌種：農(nóng)桿菌菌株GV3101、黃萎病病原菌菌株V991為實(shí)驗(yàn)室保存；VIGS病毒載體pYL156及包含TRV::RNAi、TRV::GhCLA1載體的農(nóng)桿菌菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。

研究所用的卡那霉素、慶大霉素、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Czapeks培養(yǎng)液配制所需試劑及其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自Sigma公司。

Czapek`s培養(yǎng)基：2.0 g/L NaNO3，1.0 g/L K2HPO4，1.0 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L KCl，2.0 mg/L FeSO4·7H2O，30.0 g/L Sucrose。PDA培養(yǎng)基：200.0 g/L 馬鈴薯，20.0g/L 葡萄糖，20.0 g/L瓊脂。LB培養(yǎng)基：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母提取物，10.0 g/L NaCl，15.0 g/L 瓊脂(固體培養(yǎng)基加)。YEP培養(yǎng)基：10.0 g/L 胰蛋白胨，10.0 g/L 酵母提取物，5.0 g/L NaCl。

1.2 方 法

1.2.1 棉花種植與培養(yǎng)

棉花種子用濃硫酸脫絨后播種于營(yíng)養(yǎng)土中，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為12 h光照/12 h黑暗，溫度為23℃。濕度保持在60%及以上，每隔5 d澆一次水，待兩片子葉展開(kāi)且真葉尚未發(fā)育時(shí)即可用于VIGS操作。

1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS方法

具體操作流程參照Gao and Shan[5]。

1.2.3 棉花的黃萎病病原菌接種

將保存于PDA培養(yǎng)基中的菌株V991轉(zhuǎn)接與新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。挑取的菌體于Czapek`s培養(yǎng)液中，25℃，200 r/min，培養(yǎng)3～5 d。將病原菌培養(yǎng)液用4層紗布過(guò)濾，利用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)病原菌濃度，用滅菌雙蒸水調(diào)整終濃度至1.0×106個(gè)孢子/mL，并加入Tween-20至終濃度0.001%。將棉株從培養(yǎng)基質(zhì)中取出，保持根部在病原菌懸浮液中1 min后取出移栽至新的培養(yǎng)基質(zhì)中；接種病原菌后的棉株于濕度達(dá)60%及以上的環(huán)境下23℃避光生長(zhǎng)24 h，后于23℃，12 h光照/12 h黑暗的光周期條件下生長(zhǎng)10 d，觀察統(tǒng)計(jì)棉株黃萎病病癥及調(diào)查發(fā)病指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhCPK基因 VIGS片段的克隆

從陸地棉GhCPK基因(基因登錄號(hào)Gh_D05G3156)序列的保守區(qū)域中選取一段532 bp的序列設(shè)計(jì)引物，并在正向引物5`端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，反向引物5`端引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，以陸地棉cDNA為模板，PCR擴(kuò)增VIGS片段。該片段連接至pEASY blunt zero克隆載體，挑取陽(yáng)性克隆送至華大基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與選取的VIGS片段序列一致。圖1

注: M,DNA marker；GhCPK為所克隆VIGS片段

Note: M, DNA marker;GhCPK, clonedGhCPKfragment

圖1 GhCPK(基因登錄號(hào)Gh_D05G3156)VIGS片段克隆PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)
Fig.1 PCR product of GhCPK fragment by agarose gel-electrophoresis mentod

2.2 GhCPK基因VIGS載體構(gòu)建

將構(gòu)建至克隆載體的GhCPKVIGS片段用EcoRI 和KpnI 雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，進(jìn)行膠回收。同時(shí)，用EcoRI 和KpnI 雙酶切VIGS病毒載體pYL156并進(jìn)行膠回收。上述雙酶切后的片段與載體使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。篩選得到陽(yáng)性克隆后，提取質(zhì)粒，用EcoRI和KpnI雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。酶切片段大小與克隆片段大小一致，證明GhCPKVIGS載體構(gòu)建成功。圖2

注: M, DNA marker；1，為所構(gòu)建的pYL156::GhCPK病毒載體EcoRI與KpnI雙酶切結(jié)果

Note: M, DNA marker; 1, the double diggested byEcoRI andKpnI results ofpYL156::GhCPKconstruction

圖2 pYL156-GhCPK載體酶切鑒定
Fig.2 The double diggested by EcoRI and KpnI results of pYL156::GhCPK construction

2.3 建立棉花VIGS技術(shù)體系

為了建立有效的VIGS技術(shù)體系，將包含TRV::GhCLA1與TRV::RNAi的農(nóng)桿菌GV3101共同侵染棉花子葉，若基因沉默效率顯著，棉花中與葉綠素合成相關(guān)基因GhCLA1基因?qū)l(fā)生沉默，棉花的葉綠素合成受到干擾，后期新出現(xiàn)的真葉表現(xiàn)為白化。研究表明，研究所使用的VIGS技術(shù)體系的基因沉默效果顯著。圖3

2.4 利用VIGS技術(shù)在棉花中沉默GhCPK基因進(jìn)行抗病功能

依據(jù)同樣的操作流程將包含TRV::RNA1與TRV::GhCPK載體的農(nóng)桿菌對(duì)棉花進(jìn)行共侵染，同時(shí)以不含目的基因片段的TRV::pYL156空載體與TRV::RNA1共侵染棉花作為陰性對(duì)照，在侵染7～10 d后，參照方法1.3.3對(duì)發(fā)生基因沉默的棉苗進(jìn)行病原菌接種，接種10 d后進(jìn)行表型觀察和發(fā)病指數(shù)調(diào)查。結(jié)果顯示，棉花中的GhCPK基因受病毒誘導(dǎo)發(fā)生沉默后，棉花幼苗的較對(duì)照更加感病且發(fā)病指數(shù)高于對(duì)照。圖4

圖3 GhCLA1基因在棉花中的基因沉默效果
Fig.3 The phenotype of silenced GhCLA1 in cotton

圖4 GhCPK基因沉默棉花接種黃萎病病原菌后表型及發(fā)病指數(shù)
Fig.4 The phenotype of silenced GhCPK in cotton and the disease index of cotton infected with Verticillium dahlia

3 討 論

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其分子生物學(xué)和功能基因組相關(guān)研究進(jìn)展遠(yuǎn)落后于諸如水稻、玉米等作物，究其原因，主要是因?yàn)槭艿椒肿由飳W(xué)工具和資源的限制。在此，我們建立了一套適用于較短時(shí)間內(nèi)快速發(fā)掘和鑒定棉花基因功能的技術(shù)體系：病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系(VIGS)。VIGS技術(shù)能夠穩(wěn)定的將所研究的目標(biāo)基因在棉花中發(fā)生基因沉默，進(jìn)而通過(guò)作物表型、生理生化指標(biāo)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行功能鑒定[1,2,3]。通過(guò)將GhGLA1 VIGS在棉花中進(jìn)行沉默，棉花葉綠素合成受到阻礙而導(dǎo)致棉花葉片發(fā)生白化現(xiàn)象，我們證明了將這一技術(shù)體系應(yīng)用到棉花是行之有效的。

利用此方法，在基因組范圍內(nèi)發(fā)掘棉花中特異性的如抗逆、品質(zhì)相關(guān)功能基因顯得尤為重要。目前，棉花中存在大量尚未發(fā)現(xiàn)的有待研究的與抗病相關(guān)的基因，在本研究中，我們利用VIGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)GhCPK基因與黃萎病抗病有關(guān)，這只是初步鑒定了該基因在棉花抗病中的功能。但是，如GhCPK基因等抗病基因在棉花中是如何調(diào)控棉花激活免疫反應(yīng)提高抗病性還是未知數(shù)，有待深入研究，并且相關(guān)分子和遺傳機(jī)理的研究方法主要參考如擬南芥抗病機(jī)理研究，在擬南芥中，大量抗病相關(guān)的分子組分及免疫機(jī)制研究已經(jīng)得到了廣泛研究。 鑒于擬南芥和棉花在基因組水平都相對(duì)保守，研究人員推測(cè)這兩個(gè)物種在抗病防衛(wèi)機(jī)制和基因功能上也是相對(duì)保守和類似的[13]。

因此，對(duì)于GhCPK基因在棉花抗病防衛(wèi)機(jī)制中的功能及其調(diào)控方式研究，我們將參考擬南芥中的相關(guān)研究開(kāi)展，以期今后利用該基因提高棉花抗病性。隨著對(duì)基因沉默機(jī)制的進(jìn)一步了解和對(duì)VIGS病毒載體的不斷開(kāi)發(fā)，VIGS體系已經(jīng)應(yīng)用于不同植物物種上，尤其是當(dāng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行基因功能研究的植物，利用VIGS技術(shù)有利于更多植物功能基因的研究。因此，VIGS將成為基因研究和植物功能基因組學(xué)研究的最有效工具。

4 結(jié) 論

將病毒誘導(dǎo)的棉花基因沉默體系應(yīng)用于研究GhCPK基因家族在棉花黃萎病抗病功能，GhCPK基因(基因登錄號(hào)為Gh_D05G3156)在棉花中發(fā)生基因沉默后棉花對(duì)黃萎病表現(xiàn)為更加敏感，發(fā)病指數(shù)明顯高于對(duì)照，該基因可能參與棉花黃萎病信號(hào)調(diào)控途徑。利用VIGS技術(shù)開(kāi)展GhCPK基因家族成員在棉花抗病中的功能研究相較于傳統(tǒng)的基因功能研究是快捷有效的。