兔源巴氏桿菌分離與鑒定

韓猛立，張星星，吳桐忠，郭強強，黃新，鐘發剛

(新疆生產建設兵團動物疾病防控重點實驗室/新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】 兔巴氏桿菌病(Rabbitpasteurellosis)是由兔多殺性巴氏桿菌(Pasteurelamultocida)引起兔的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，呈多形性、散發性或地方流行性傳染病，又稱為兔出血性敗血癥[1-2]；該病是家兔的常見疾病之一，主要危害斷奶到成年兔(多發于9周齡至6月齡)，臨床上表現為嚴重的呼吸道病變、中耳炎、結膜炎、子宮積膿、睪丸炎等[3]；一般無季節性發病特征，在氣溫驟變及多雨季節發病較多；通常呈隱性感染，在感染群中，隨著兔年齡的增大，多殺性巴氏桿菌在兔群中的污染率有增加的趨勢；該病發病率高，傳播途徑多，傳播速度快，發病后若治療措施不及時可引起兔大批死亡，若治療措施及時可明顯降低死亡率，但也會引起兔生長遲緩及治療費用增加等，該病已成為困擾我國養兔業健康發展的主要細菌性疾病之一[4-6]。【前人研究進展】 多殺性巴氏桿菌能夠引起禽霍亂、牛出血性敗血癥、兔巴氏桿菌病、羊出血性敗血癥、豬肺疫和豬萎縮性鼻炎，而人可以通過被狗、貓等寵物撕咬或抓傷的途徑感染巴氏桿菌，并引起人的局部感染、炎癥或敗血癥，病情嚴重時甚至造成死亡[7]。我國科研人員在牛、豬、禽類、兔巴氏桿菌[3,8-12]的分離鑒定、PCR檢測方法與血清分型、耐藥性、致病性、免疫原型研究方面做了大量的研究工作，豐富了我國不同種動物巴氏桿菌病研究的深度和廣度，對促進畜禽養殖業健康發展、控制巴氏桿菌對畜牧養殖業造成的危害、減少養殖場(戶)的經濟損失做出了重大貢獻。【本研究切入點】 姜鴻程等[13]2002年對哈密地區發生一起兔巴氏桿菌與大腸桿菌混合感染進行報道。有禽源、奶牛源、羊源、牦牛源巴氏桿菌的相關研究[14-18]，新疆地區關于兔巴氏桿菌的相關研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】研究對引起石河子地區不同養兔合作社或專業養殖戶兔死亡的原因進行探究，確定其主要病原菌為多殺性巴氏桿菌，并伴有大腸桿菌混合感染，對分離菌株的耐藥性進行分析研究。掌握巴氏桿菌感染不同種動物的臨床特點、致病特征、主要血清型、敏感藥物、序列特點等，為制定動物源巴氏桿菌病綜合防控措施提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料

采集和送檢病料主要來自第八師石河子市轄區的145團、133團、121團、149團養兔合作社或養兔專業戶，主要飼養法系獺兔、哈白、新西蘭、伊普呂、寵物兔等。發病主要集中4、5月，病兔多為50～75 d齡，主要臨床癥狀為厭食、打噴嚏、咳嗽、流膿性鼻漏的呼吸道型；部分兔用前爪抓擦鼻孔，臨死前出現體溫下降，全身抽搐，并伴有水樣腹瀉；病程一般為3～5 d，發病率45%～65%，病死率40%以上，多為急性死亡。對送檢的病死兔剖解可見肺臟充血、肝變較嚴重，呈大理石樣花紋，有纖維素性胸膜炎變化，有化膿灶；肝臟水腫、膽囊腫大、邊緣頓圓、質脆，腸系膜淋巴結明顯水腫出血；腸道廣泛性出血。

剖解瀕死期或病死兔，無菌采集肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結等病料，4℃冷藏備用。標準牛多殺性巴氏桿菌(CVCC393)購自中監所(簡稱：標準株)。

1.1.2 培養基及試劑

5%綿羊血液瓊脂平板培養基、普通瓊脂平板培養基、麥康凱瓊脂培養基、營養肉湯、腦心浸液(BHI)；TaqDNA聚合酶 、dNTP、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；快速革蘭氏染色液、瑞氏-姬姆薩染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。臨床常用新藥敏紙片(30種)購自杭州濱和微生物試劑有限公司。法國生物梅里埃VITEK 2 COMPACT全自動微生物生化鑒定系統及其配套細菌生化鑒定卡；昆明系小鼠購自石河子大學動物實驗中心。

1.1.3 引物合成

參照Townsend等[19]建立了多殺性巴氏桿菌PCR鑒別和莢膜血清分型方法，分別設計引物擴增多殺性巴氏桿菌種特異性基因KMT1，擴增莢膜血清A、B、D、E、F分型特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及擴增片段大小。表1

表1 巴氏桿菌鑒定及分型引物序列
Fig.1 Primer sequences and sizes used in experiments

血清型Capsular serotype引物Primers序列Sequences(5’-3’)大小Sizes(bp)Pm鑒定Identification of PmKmt-1Pm-FATCCGCTATTTACCCAGTGGPm-RGCTGTAAACGAACTCGCCAC460A型Pm鑒定Identification of A type PmhyaD-hyaCPmA-FTGCCAAAATCGCAGTCAGPmA-RTTGCCATCATTGTCAGTG1 046B型Pm鑒定Identification of B type PmbcbDPmB-FGCCCGAGAGTTTCAATCCPmB-RCATTTATCCAAGCTCCACC760D型Pm鑒定Identification of D type PmdcbFPmD-FTTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCCPmD-RCATCTACCCACTCAACCATATCAG657E型Pm鑒定Identification of E type PmecbJPmE-FTCCGCAGAAAATTATTGACTCPmE-RGCTTGCTGCTTGATTTTGTC511F型Pm鑒定Identification of F type PmfcbDPmF-FAATCGGAGAACGCAGAAATCAGPmF-RTTCCGCCGTCAATTACTCTG851

1.2 方 法

1.2.1 染色鏡檢

將病料組織如肺臟、肝臟、脾臟、腸內容物涂片或觸片，分別進行瑞氏染色和革蘭氏染色、鏡檢、觀察其形態特征。

1.2.2 分離培養

將無菌采集的病兔肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結分別接種于腦心浸液置于37℃恒溫培養18～24 h后，接種于血液瓊脂平板、普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板37℃恒溫培養16～18 h，觀察在不同培養基上的生長情況、菌落形態以及溶血情況。挑取典型菌落，分別進行單菌落涂片革蘭氏染色鏡檢、再次接種于5%綿羊血瓊脂平板進行分離純化、觀察其溶血性。

1.2.3 生化鑒定

分離菌株的生化鑒定應用常規生化鑒定與全自動微生物生化鑒定系統相結合進行。常規細菌生化鑒定管購買自杭州濱河微生物試劑有限公司，革蘭氏陰性細菌鑒定卡購買自法國生物梅里埃公司。

1.2.4 動物試驗

10只普通健康小白鼠(體重約在20 g左右)，隨即分為試驗組和對照組，每組5只。將經生化鑒定的分離菌株挑單個菌落37℃過夜培養，用滅菌PBS懸浮菌體；試驗組小白鼠按0.2 mL/只(6×108cfu/mL)劑量腹腔注射，對照組注射等量滅菌PBS。隔離飼養，同時觀察并記錄小鼠狀態、發病及死亡情況。

1.2.5 藥敏試驗

按照常規方法進行，采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)進行藥物敏感性試驗，使用杭州濱河微生物試劑有限公司生產的臨床常用新藥敏紙片(30種)，觀察實驗結果，并測量抑菌圈直徑，按照配套說明書判定結果，以牛多殺性巴氏桿菌CVCC3933作為質控菌株。

1.2.6 PCR鑒定及分型

將分離菌株接種于營養肉湯37℃過夜培養，用堿裂解法提取細菌基因組DNA作為PCR模板；PCR擴增引物詳見1.1.4；反應體系：25 μL：10 × Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL(20 μmol/L)，TaqDNA聚合酶 0.5 μL(5 U/μL)，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 16.0 μL；反應條件：95℃ 預變性 5 min；95℃ 變性 30 s、56℃ 退火 30 s、72℃ 延伸35 s，30個循環；72℃ 5 min。PCR產物保存于4℃備用。取5 μL PCR產物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 細菌形態

病兔肺臟、肝臟、脾臟和腸內容物涂片革蘭氏染色鏡檢，視野可見大量呈粉紅色(革蘭氏陰性)的小桿菌；瑞特氏染色觀察到兩極著色的短桿菌，偶見有著色均勻的短小桿菌。

2.2 細菌分離培養

將無菌采集的病料接入營養肉湯中培養72 h后，肉眼可見試管底部出現粘稠，晃動呈拉絲狀；分離菌株在普通瓊脂培養基上貧瘠，在麥康凱上(除其中一份腸系膜淋巴結病料，生長出粉紅圓形菌落外)均不生長；在5%綿羊血瓊脂平板上培養18 h后，可見表面光滑濕潤、灰白色、圓形微隆起、邊緣整齊的露珠樣菌落，無溶血現象；革蘭氏染色為陰性短小桿菌。

2.3 生化鑒定

對分離菌株應用購買自天和微生物試劑有限公司的細菌生化鑒定管和全自動微生物鑒定儀鑒定，疑似為多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)。研究表明，全自動微生物鑒定系統鑒定結果提示為巴氏桿菌(可信度介于91%～99%)；其中CVCC393為標準菌株，PmXJ12104-x為實驗室保存的牦牛巴氏桿菌分離株，PmXJ08145-xby、PmXJ08132-f、PmXJ08132-x、PmXJ08121-f、PmXJ08149-xby為此次分離的兔源巴氏桿菌。分離株與標準菌株生化鑒定結果基本一致。腸系膜淋巴上分離菌株鑒定為大腸桿菌。表2

表2 分離株生化試驗結果
Table 2 The result of biochemistry to experiment

菌株StrainCVCC393PmXJ12104-xPmXJ08145-xbyPmXJ08132-fPmXJ08132-xPmXJ08121-fPmXJ08149-xby葡萄糖 GLU+++++++靛基質 IMD+++++++甘露醇 MAN+++-+++麥芽糖 MAL---+-+-山梨醇 SOR+++++++乳糖 LAC-------蔗糖 SAC+++++++果糖 FRU+++++++甲基紅 MR-------二乙酰 VP-------檸檬酸CIT-------尿素酶 URE-------硫化氫 H2S-------硝酸鹽 CIT++++--+觸酶 CAT+++++++三糖鐵 TSI+++++++

注：+(陽性)；-(陰性)

Note: +(positive)；-(Negative)

2.4 動物試驗

試驗組小白鼠接種注射菌液后4 h，出現精神不振，食欲下降；14 h后，注射Pm的小鼠有1只死亡；36 h以內小鼠全部死亡；空白對照組小鼠全部存活。剖解可見心外膜有出血點、心包和胸腔呈現不同程度漿液性纖維素滲出物，肺出血嚴重、肝臟、脾臟、淋巴結腫大；腹腔積液、腸粘膜出血。選取心血、肺臟、肝臟、脾臟等組織病料涂片鏡檢，革蘭氏染色可見陰性小桿菌，瑞氏染色可見兩級著色顯著的短桿菌，判定為巴氏桿菌感染。

2.5 分離菌株耐藥率

對分離鑒定獲得的14株兔巴氏桿菌(進一步鑒定明確為PmXJ08145-xby、PmXJ08132-f、PmXJ08132-x、PmXJ08121-f、PmXJ08149-xby5株菌)，按照CLSI標準測定其對30種臨床常用新藥敏紙片的敏感性，結果顯示，14株巴氏桿菌均表現出不同程度的多重耐藥，對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、四環素、阿莫西林、慶大霉素、克林霉素、恩諾沙星等臨床常用抗生素嚴重耐藥，較為敏感的抗生素是第三代頭孢菌素類如頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟，部分喹諾酮類如氧氟沙星、左氧氟沙星以及氟苯尼考。按照“高敏菌株數 + 中敏菌株數 = 敏感菌株數”和“低敏率=耐藥率”，確定分離菌株的耐藥率。表3

表3 14株兔源多殺性巴氏桿菌分離菌株的藥敏試驗結果
Table 3 Susceptibility of 14 strains of Pasteurella multocida isolates

藥敏片類別Drug sensitive tablets敏感(S)Sensitive中介(I)Intermediary耐藥(R)Resistance耐藥率(%)Resistant rate苯唑西林 Oxacillin041071.43(10/14)青霉素G Penicillin G011392.86(13/14)阿莫西林 Amoxicillin0014100.00(14/14)阿奇霉素 Azithromycin47321.43(3/14)氟苯尼考 Florfenicol9417.14(1/14)氨芐西林 Ampicillin021285.71(12/14)多西環素 Doxycyclinum031178.57(11/14)克林霉素 Clindamycin0014100.00(14/14)氯霉素 Chloramphenicol05964.29(9/14)四環素 Tetracycline011392.86(13/14)左氧氟沙星 Levofloxacin5817.14(1/14)諾氟沙星 Norfloxacin08642.86(6/14)恩諾沙星 Enrofloxacin57214.29(2/14)環丙沙星 Ciprofloxacin36535.71(5/14)多粘菌素B Polymyxin B56321.43(3/14)復方新諾明 Cotrimoxazole021285.71(12/14)哌拉西林 Piperacillin011392.86(13/14)頭孢唑啉 Cefazolin65321.43(3/14)頭孢噻吩 Cefalotin53642.86(6/14)頭孢呋辛 Cefuroxime66214.29(2/14)頭孢哌酮 Cefoperazone11300.00(0/14)頭孢噻肟 Cefotaxime12200.00(0/14)頭孢曲松 Ceftriaxone10400.00(0/14)頭孢他啶 Ceftazidime13100.00(0/14)頭孢吡肟 Cefepime11300.00(0/14)頭孢西叮 Cefoxitin38321.43(3/14)氧氟沙星 Ofloxacin6717.14(1/14)鏈霉素 Streptomycin011392.86(13/14)卡那霉素 kanamycin14964.29(9/14)慶大霉素 Gentamicin031178.57(11/14)

圖1 14株兔源多殺性巴氏桿菌分離菌株的藥敏試驗
Fig.1 Susceptibility of 14 strains of Pasteurella multocida isolates

2.6 PCR鑒定及分型

以巴氏桿菌標準菌株CVCC393和實驗室分離保存的牦牛巴氏桿菌PmXJ12104-x分離株為陽性對照，以實驗室分離獲得14株菌的DNA為模板，分別擴增Pm的Kmt-1基因，研究表明，除陰性對照外均擴增出大小約460 bp的目的條帶與預期結果一致。將分離菌株的Kmt-1基因片段測序后運用BLAST與GenBank數據庫中多殺性巴氏桿菌KMT-1基因序列比對同源性達99%以上。

根據發病場區、養殖品種、臨床癥狀、生化鑒定，結合莢膜血清分型將分離的14株巴氏桿菌明確為PmXJ08145-xby、PmXJ08132-f、PmXJ08132-x、PmXJ08121-f、PmXJ08149-xby 5株菌，應用莢膜血清分型PCR鑒定為A型多殺性巴氏桿菌。 對擴增獲得的血清特異性基因片段測序，運用BLAST搜索比對結果顯示與Genbank 數據庫中A型基因同源性介于97%～99%。圖1

M：DNA分子質量標準；1.陰性對照；2.標準多殺性巴氏桿菌CVCC393；3.牦牛巴氏桿菌分離株PmXJ12104-x；4-17：兔源臨床分離菌株

M:DL2000 Marker; 1.Negative control; 2.StandardPasteurellamultocidaCVCC393; 3.Pasteurellamultocidaisolate PmXJ12104-x of Yak; 4-17.Rabbits source clinical isolates

圖2 多殺性巴氏桿菌PCR鑒定
Fig.2 PCR identification of Pasteurella multocida

M：DNA分子質量標準；1-5：兔源臨床分離株

M:DL2000 Marker; 1-5:.Rabbits source clinical isolates

圖3 分離菌株莢膜血清型PCR鑒定
Fig.3 Isolation Strains capsular serotype PCR identification

3 討 論

隨著兵團農業產業化結構調整步伐的逐步推進，兵團第八師石河子地區畜牧業結構呈現出多元化發展，在傳統的以奶牛、細毛羊養殖為優勢的基礎上；為了更好的適應市場需求，拓寬農牧民多元化增收途徑，以肉羊、肉牛、生豬、蛋雞和肉兔養殖。家兔多殺性巴氏桿菌病是引起斷奶到成年兔斷奶到死亡最主要的細菌性傳染病，不同國家的主要流行菌株不同，不同血清型巴氏桿菌之間沒有或僅有較少的交叉保護性[20]。

多殺性巴氏桿菌是一種普遍存在于多種動物體內的革蘭氏陰性短桿菌，能在部分健康動物的口腔、鼻腔、扁桃體和上呼吸道中定植，屬于條件致病菌。根據莢膜抗原的不同分為5種血清型，分別是 A、B、D、E和F型[21]，血清型的流行情況在不同宿主間有一定差異[22]。當前在我國豬群中主要流行的是A型、B型(引起豬肺疫)和D型(豬傳染性萎縮性鼻炎)[23]；牛群中主要流行A型(牛出血性敗血癥)[24]；羊源巴氏桿菌病以病例報道居多，分型鑒定相對較少，新疆地區有分離到A型的相關報道[17]；禽類以A型(禽霍亂)為主，B 、D和F型也有報道[23]；兔源以A型為主，但也存在D型和F型[10,25]。2016年4月～2017年10月間對石河子地區132團首先出現4月齡左右仔兔突然發病死亡，隨即周邊團場或與其有來往的養殖合作社和養殖專業戶發生了類似的疫情。經詢問飼養員和獸醫，結合發病情況、臨床癥狀及剖解變化，類似于巴氏桿菌病；此次發病表現出發病率和死亡率均較高的特點，且剖解以肺部病變較為嚴重，部分呈現出大腸桿菌性腹瀉混合感染；給處于上升期的石河子地區養兔業造成巨大的經濟損失。研究團隊利用現有的巴氏桿菌研究平臺，對不同時期的發病樣品經實驗室細菌分離鑒定出14株巴氏桿菌，后進一步明確為5株，分離菌株生化鑒定結果與標準菌株生化特性基本一致，將分離菌株進行小鼠攻毒試驗表現出高致病性，并分離出相同的細菌，初步鑒定為多殺性巴氏桿菌感染；分離菌株對臨床常用的藥物均具有不同程度的耐藥性，對第三代頭孢菌素和部分喹諾酮累藥物表現出敏感性，且敏感趨勢大致相同；在培養特性、生化特點、藥物敏感性及毒力上存在一定的差異；利用PCR技術最終確認分離的菌株為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，且具有較強的致病性，對第三代頭孢菌素類、部分喹諾酮類藥物和氟苯尼考敏感。

多殺性巴氏桿菌廣泛存在于正常動物的上呼吸道、扁桃體等器官和組織中，因而動物群體中多殺性巴氏桿菌的帶菌率與動物群體是否發生巴氏桿菌病并無直接關系。一般認為動物在發病前已經帶菌，當各種誘因如氣溫變化、應激等使畜禽機體抵抗力降低時，病原菌得以快速繁殖，隨即侵入體內，經淋巴液而入血液，繼而發生內源性感染，促進動物機體表現出特定的臨床癥狀，嚴重者導致死亡。研究采集病死兔的臟器組織，運用傳統的生物學分析方法將純化后的細菌依據染色形態、生化試驗等特征進行分類，由于傳統生物學細菌鑒定方法穩定性和可靠性受到培養條件的影響而存在差異；分子生物學方法不受細菌來源地環境及培養條件的影響[26]。研究采用傳統細菌分離鑒定與分析生物學相結合的方法，應用全自動微生物鑒定系統與傳統生化試驗相作證；以實驗室購買的標準菌株和分離菌株作為陽性對照，參考目前普遍認可的由Townsend等[19,27]建立的分子生物學方法對多殺性巴氏桿菌進行鑒定和分型，二者的符合率一致；相對于傳統的表型鑒定方法，基因型鑒定提高了檢測和分類的穩定性，同時提高了揭示其種間遺傳關系的檢測速率。

多殺性巴氏桿菌各血清型菌株的流行性存在較大差異，具有明顯的地方性特征；致病性主要與宿主和細菌毒力相關，毒力基因在細菌致病過程中具有重要意義，很多被證實與病原菌致病密切相關的結合、轉運、粘附、定殖、合成、入侵等過程均有不同基因編碼的對應蛋白(酶)介導，機體發病是宿主與致病菌株之間相互作用的結果。多殺性巴氏桿菌毒力基因較多，與之密切相關的毒力基因在不同菌株中分布存在一定的差異。研究揭示了莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌是引起石河子地區兔急性死亡的主要病原菌，對其毒力基因進行相關研究是本實驗即將開展的工作。

兔多殺性巴氏桿菌對于任何品種兔子均具有相同的易感性，且無性別差異，但不同年齡兔只的易感性存在顯著差異。兔多殺性巴氏桿菌屬條件性致病菌，當外界條件發生突然改變如更換飼養和飼養員、寄生蟲感染、溫度驟變、圈舍通風不良、兔抵抗力降低時，該病原菌趁機侵入人體內，引發內源性感染或突然發病。因此應做好日常管理和預防工作，大量文獻報道發現不同地區分離株藥敏試驗結果大相徑庭，可能不同地區及人員與用藥習慣和分離菌株的差異有關，首選藥敏試驗結果的藥物進行治療，同時選擇不同敏感藥物交替使用、聯合用藥方能起到較好的效果；兔巴氏桿菌商品疫苗為莢膜血清A型滅活疫苗，因此制定完善的免疫程序、應用市售商品化疫苗防控該病是首選方案；同時必須對本地流行的多殺性巴氏桿菌血清型加以監測，根據當地監測結果才能更好地指導該病的防治。

4 結 論

通過常規細菌分離獲得14株病原菌，鑒定為巴氏桿菌；應用分子生物學方法鑒定為莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌，結合考慮發病場(戶)、是否分離自同一樣品、生化試驗、序列比對等明確為5株病原菌，分別命名為PmXJ08145-xby、PmXJ08132-f、PmXJ08132-x、PmXJ08121-f、PmXJ08149-xby5；按照CLSI標準測定其對30種臨床常用新藥敏紙片的敏感性，結果顯示14株臨床分離巴氏桿菌均表現出不同程度的多重耐藥，對青霉素、阿莫西林、鏈霉素、四環素、阿莫西林、慶大霉素、克林霉素、恩諾沙星等臨床常用抗生素嚴重耐藥的抗生素是類如對頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟等第三代頭孢菌素，部分喹諾酮類如氧氟沙星、左氧氟沙星以及氟苯尼考等較為敏感。