補飼大蒜素對伊犁馬抗疲勞及免疫力的影響

莫緒成，曾亞琦,2，王建文,2，孟軍,2，姚新奎,2，賽亞熱·艾尼玩爾，梅香

(1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學馬產業研究院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大蒜素作為綠色飼料添加劑，在畜禽生產中應用較多。不同動物的機體生理活動不完全相同，故大蒜素對其作用效果、影響機理也存在一定區別，補飼適量的大蒜素可以作用于家禽的免疫系統從而影響機體的免疫球蛋白分泌，另一方面，大蒜素也可以作用于運動屬性動物機體的乏氧誘導因子生成，從而減少缺氧狀態下組織細跑的損害。因此，通過試驗逐步認識大蒜素在運動馬日糧中的添加效果，深入探討其作用機理，并選擇出適宜的補飼劑量，對于運動馬的健康具有重要的理論價值與實踐意義，也可以為運動馬飼料添加劑的研發做參考依據，為運動馬的科學飼養管理提供理論參考。【前人研究進展】現有研究普遍認為大蒜素是一種天然植物性廣譜抗生素，具有增強機體免疫力、抗氧化、清除自由基等功能，在各種動物飼料中添加大蒜素，能夠提高動物的成活率，減少患病率[1,2]。張小永等[3]研究認為補飼大蒜素能夠實現增強動物機體非特異性免疫功能的效果。大蒜素可通過影響機體運動的自由基代謝、心肌與骨骼肌的微損傷程度、炎癥反應和心血管調節能力等方面，來緩解運動性疲勞[4,5]。【本研究切入點】目前國內對于大蒜素的應用研究主要集中在提高動物免疫力方面，而針對大蒜素的抗疲勞作用也有一些初步的研究[6]。目前，將大蒜素的免疫作用和抗疲勞作用運用在同一試驗對象上的研究較少，試驗通過研究補飼不同劑量大蒜素對伊犁馬運動后血液指標的變化規律，研究大蒜素對運動型馬匹的抗疲勞和增強免疫能力的影響。【擬解決的關鍵問題】通過對四組伊犁馬測試賽后即刻血液進行檢測，分析不同劑量組馬匹運動后血液指標的變化規律以及大蒜素抗疲勞和增強機體免疫力的作用效果，量化大蒜素補飼劑量，為伊犁馬的日常生產提供數據支持，為馬匹健康養殖提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物

試驗地點位于新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣西域賽馬場。

選取16匹3～4歲健康伊犁馬母馬為試驗動物，體尺、體重相近，試驗前馬匹均進行較為系統地調教訓練，試驗過程中所有馬匹進行集中飼養管理。試驗馬匹均由新疆昭蘇縣西域馬業有限責任公司提供。

試驗馬匹采用單廄飼養管理模式，粗飼料(干牧草)每匹馬每天的飼喂量要保證充足(自由采食)，自由飲水。飼喂粗飼料時間為每天早上08:00，13:30，18:00 和23:00。馬廄按規定時間打掃，糞便和墊料要及時清除，按時為圈舍換干燥柔軟的墊草，保持圈舍舒適條件，確保馬匹長期處于舒適狀態。

1.1.2 試驗器材

德國產H/P/cosmos便攜式血乳酸分析儀(含試片)、真空采血管(含采血針)、離心機、保溫箱、移液槍(含槍頭)、日立 7600系列自動生化分析儀、MAGLUMI 4000 Plus全自動化學發光免疫分析儀等。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將所選馬匹隨機分為4組(對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組)，每組4匹。每匹馬每天補飼4 kg精料(分兩次飼喂，每次2 kg)，每次補精料的時間為08:20，18:20。對照組精料中不添加大蒜素，試驗I組、II組和III組精料中分別添加大蒜素100、300和500 mg/kg[7]。在補喂精料時，將預先稱量封裝好的大蒜素分別按劑量拌入其中，采食結束后，將馬匹牽入活動場，讓其自由活動，隨后統一安排訓練。對所選馬匹進行為期30 d試驗，其中在第0 d、第10 d、第20 d和第30 d進行1 000 m速度測試賽，并于測試賽結束后即刻采集靜脈血樣本2管。

1.2.2 測定指標

將其中一管血液樣本通過H/P/cosmos便攜式血乳酸分析儀測定血液樣本中血乳酸(LAC)含量。另一管血液樣本靜置后，使用離心機進行3 500 r/min 離心15 min分離血清，分離后將血清置于-20℃保存待測。采用日立全自動生化儀(7600)測定鈣離子(Ca2+)與鉀離子(K+)、谷丙轉氨酶(ALT)與谷草轉氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸(LAC)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、補體C3(C3) 補體C4(C4)。

1.3 數據處理

使用Excel軟件對試驗測定結果進行數據整理，運用SPSS 21.0軟件對測定數據進行雙因素方差分析，結果以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 飼喂時間對疲勞和免疫的影響

研究表明，K+濃度在飼喂第20 d時顯著低于第0 d(P<0.05)，與第30 d時差異不顯著(P>0.05)；第0 d、第10 d和第30 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。Ca2+濃度在飼喂第30 d時顯著低于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.05)，但第0 d、第10 d和第20 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。AST活性和ALT活性在飼喂第30 d時顯著高于第0 d(P<0.05)，與第10 d和第20 d之間差異均不顯著(P>0.05)，第10 d和第20 d時均與第0 d差異不顯著(P>0.05)。CK活性在飼喂第30 d時極顯著高于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.01)，第0 d、第10 d和第20 d兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。CK-MB活性在第30 d時極顯著高于第10 d(P<0.01)，顯著高于第0 d(P<0.05)；第10 d時和第0 d時差異不顯著(P>0.05)，第20 d時與其余各組間差異均不顯著(P>0.05)。LDH活性在第30 d時極顯著高于第10 d(P<0.01)；第10 d時顯著低于第0 d時(P<0.05)；第20 d時與其余各組間差異均不顯著(P>0.05)。LAC濃度在飼喂第10 d時顯著低于第0 d時(P<0.05)，第20 d和第30 d均與第0 d之間差異不顯著(P>0.05)。表1

表1 血漿中電解質及生化指標隨時間變化
Table 1 Changes of electrolytes and biochemical parameters in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)K+ (mmol/L)6.11±1.14a6.31±2.54a4.51±0.89b5.24±1.79abCa2+ (mmol/L)3.12±0.11a3.13±0.14a3.14±0.20a2.99±0.11bAST (IU/L)442.07±94.16b493.45±169.54ab508.91±175.91ab671.33±346.80aALT (IU/L)17.67±4.45b18.64±5.20ab17.82±6.01ab24.92±14.13aCK (U/L)321.20±110.14B301.91±116.18B378.64±153.23B604.67±317.14ACK-MB (U/L)340.93±77.76ABb294.73±73.12Bb352±62.57ABab408.08±86.54AaLDH ( U/L)488.27±102.78ABa416.36±65.98Bb442.91±64.02ABab505.75±72.70AaLAC (mmol/L)19.89±1.89a16.72±5.52b19.11±1.98ab18.55±2.55ab

注：同行不同大寫字母表示極顯著差異，P<0.01；同行不同小寫字母表示顯著差異，P<0.05。下同

Note:Different capital letters in one row extremely significant differences (P<0.01),different lowercase letters show significant differences (P<0.05). The same as below

根據不同飼喂時間分組，免疫指標分析結果表明，IgM、IgG、C3和C4在補飼不同階段差異性不顯著(P>0.05)。表2

表2 血漿中免疫指標隨時間變化
Table 2 Changes of immune index in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)IgM (g/L)0.57±0.180.60±0.210.53±0.200.56±0.17C4 (g/L)0.033±0.0120.032±0.0120.032±0.0090.030±0.010IgG (g/L)8.15±0.608.16±0.658.13±0.508.06±0.65C3 (g/L)0.18±0.020.17±0.020.19±0.030.19±0.03

2.2 飼喂劑量對疲勞和免疫的影響

研究表明，K+濃度隨著添加量的增加有略微的波動，在添加300 mg/kg時達到最高值，但各組間差異不顯著(P>0.05)。Ca2+濃度隨著大蒜素添加量的增加出現了一定的降低現象，差異不顯著(P>0.05)。AST活性在添加500 mg/kg時顯著高于添加100 mg/kg時(P<0.05)，添加300 mg/kg和0 mg/kg時與添加100 mg/kg和500 mg/kg時差異均不顯著(P>0.05)。ALT活性在添加500 mg/kg時最高，但各劑量組中差異不顯著(P>0.05)。CK活性在添加100 mg/kg時顯著低于對照組(P<0.05)，添加300 mg/kg和添加500 mg/kg時與其余各組間差異不顯著(P>0.05)。CK-MB活性在添加300 mg/kg時極顯著低于對照組(P<0.01)，添加500 mg/kg時顯著低于對照組(P<0.05)，添加100 mg/kg時與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。LDH活性在添加500 mg/kg時極顯著高于對照組(P<0.01)，添加300 mg/kg時顯著高于對照組(P<0.05)，添加100 mg/kg時與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。LAC活性在對照組略微高于其他劑量組，但差異不顯著(P>0.05)，且乳酸值在100 mg/kg組，300 mg/kg組與500 mg/kg組相互之間差異不顯著(P>0.05)。表3

研究表明免疫球蛋白M濃度在添加100、300和500 mg/kg時均極顯著高于對照組(P<0.01)，但各組間差異兩兩間均不顯著(P>0.05)。補體C4濃度在添加300 mg/kg時極顯著高于添加100 mg/kg時和對照組(P<0.01)，顯著高于添加500 mg/kg(P<0.05)，添加100、500 mg/kg和對照組兩兩間差異均不顯著(P>0.05)。免疫球蛋白G和補體C3濃度隨著大蒜素的增加呈現一定的波動，但各組間差異不顯著(P>0.05)。表4

表3 血漿中電解質及生化指標變化隨補飼濃度變化
Table 3 Changes of electrolyte and biochemical index in plasma with the change of supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgK+ (mmol/L)5.32±0.955.49±1.816.28±2.585.28±1.31Ca2+ (mmol/L)3.17±0.183.07±0.143.09±0.103.08±0.16AST (IU/L )582.9±300.19ab411.25±85.03b517.91±196.20ab633.92±257.61aALT (IU/L)19.80±10.2019.00±5.9716.45±4.3423.50±12.02CK (U/L)511.5±350.82a348.44±96.18b383.09±247.15ab388.00±171.52abCK-MB (U/L)407.80±85.20Aa358.00±94.51ABab313.91±76.70Bb322.17±41.38ABbLDH (U/L)406.80±55.62Bb456.06±79.87ABab481.27±99.79ABa515.50±72.75AaLAC (mmol/L)20.14±1.5918.17±4.8218.72±2.0818.08±2.79

表4 血漿中免疫指標隨補飼濃度的變化
Table 4 changes of immune index in plasma with supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgIgM (g/L)0.37±0.05B0.57±0.20A0.58±0.08A0.69±0.18AC4 (g/L)0.029±0.006Bb0.029±0.011Bb0.043±0.005Aa0.033±0.008ABbIgG (g/L)8.17±0.368.32±0.718.12±0.417.84±0.64C3 (g/L)0.18±0.020.19±0.020.18±0.020.18±0.04

3 討 論

3.1 飼喂時間對疲勞和免疫的影響

疲勞的產生機制比較復雜，其涉及到神經-內分泌-免疫網絡的功能協調，是一個周而復始的循環鏈式反應，其中每一個環節都有可能嚴重影響到疲勞的發生和疲勞的程度，測定運動后K+、Ca2+濃度水平可用于評價動物機體的損傷程度與疲勞程度[8]，K+通道是心臟電位活動中比較重要的離子通道之一，構成心肌細胞靜息電位和動作電位復極的主要離子流，大蒜素可能阻滯心房肌細胞上的超極化激活的延遲整流鉀電流，并且大蒜素的抗氧化作用也能減輕細胞內鈣離子超載情況，緩解與鈣離子超載相關的缺血再灌注損傷，從而能夠抑制大強度運動后K+、Ca2+大量滲透到細胞外的現象[9]，試驗結果與其研究類似。

ALT與AST廣泛分布在動物肌細胞和肝細胞內，在正常情況下血清中ALT與AST含量穩定于一定水平。有研究證實，短跑運動員在不同強度運動訓練下，血清AST、ALT的活性均有所增強[10]。劉敏等[11,12]研究發現，日糧添加大蒜素干粉，可以使哈薩克羊血清中AST、ALT檢測值呈現顯著性升高，但在正常范圍之內，未對肝臟與肌肉等組織造成較大損傷。在補飼大蒜素后，血清AST、ALT均有所增加。

LDH對機體在缺氧狀態下運動時能量的產生、供應以及乳酸代謝都有著十分重要的意義，所以LDH濃度高低可用來評價肌肉組織的無氧代謝能力，作為無氧氧化的標志酶[13]。金宏等[14]研究，在對大鼠進行游泳訓練后，發現大鼠在運動后 LDH濃度明顯上升，試驗隨著正常訓練LDH濃度逐漸增高與前人研究相符。LAC被作為判斷疲勞程度的重要指標之一[15]，用于評價運動馬的運動性能[16]。LAC主要是由劇烈活動的骨骼肌細胞產生，彌散出胞膜后在體液中被稀釋轉運到體內其他部位進行代謝。LAC作為體液的一部分，其濃度值取決于肌纖維細胞產生LAC的速度，同時還取決于LAC的彌散情況及糖異生轉換的速度等。李玉娟等[17]研究表明在缺氧狀態情況下，加用一定量的大蒜素干預后，乏氧狀態得到明顯改善，大蒜素有改善細胞缺氧狀態的作用，長時間的大蒜素補飼有助于降低賽后LAC濃度，增強無氧代謝能力，試驗結果與其一致。試驗結果顯示免疫指標變化不大，大蒜素的累積效應在試驗中表現不明顯。

3.2 飼喂劑量對疲勞和免疫的影響

以不同飼喂劑量分組時，血漿中各指標變化明顯，CK具有一定代表性，CK 參與線粒體呼吸、糖酵解的控制和肌肉收縮供能。通過訓練運動強度增加，肌纖維收縮時產生的牽拉力變大，使細胞膜的通透性增強，致使更多酶分子進入血液，會出現CK濃度升高的現象[18]。CK在不同組織中有不同的表達，共可分為CK-MM、CK-MB、CK-BB三種亞型，其中在骨骼肌中超過95%是CK-MM形式，其組織特異性能可以準確地反映骨骼肌細胞的損傷情況和機能狀態。有研究發現，大蒜素可以減輕離心運動造成的骨骼肌超微結構的損傷，保護細胞膜的通透性和完整性[19]。在大蒜素對心肌細胞微損傷的研究中，CK、CK-MB 水平降低，說明大蒜素對心肌微損傷有一定的保護作用[20]，試驗結果與前人研究一致。免疫蛋白是衡量機體免疫功能強弱的重要指標，在一定范圍內血清中的球蛋白含量越高，可以反映出動物機體的抗病能力越強。血清中的球蛋白來源于B細胞，是機體內抗體的主要表現形式和物質基礎，在機體的體液免疫過程中起主導作用，飼喂大蒜素能夠極顯著提高免疫球蛋白M的含量[21]，試驗結果與其基本一致。補體C4是補體系統經典途徑中的主要成分，它在機體防御過程中可以清除病原微生物，并通過活化炎性細胞對靶細胞的殺傷作用來提高機體的免疫機能。黃旭雄等[22]研究發現補飼大蒜素對水產動物的補體C4有顯著的促進作用。唐玲[23]在植物添加劑對鏡鯉作用的研究中發現，0.5%大蒜莖粉能顯著提高血清C4活性，試驗結果顯示，飼喂大劑量組大蒜素飼料后，血清C4活性較對照組顯著增加，與前人研究結果相近。試驗表明大蒜素補飼劑量較高的試驗組可以通過提高AST和LDH，降低CK和CK-MB來實現抗疲勞作用，并且高劑量組可以通過提高免疫球蛋白M和補體C4來增強機體的免疫力。添加300～500 mg/kg大蒜素可以有效提升馬匹抗疲勞能力和機體免疫力。

4 結 論

試驗通過對伊犁馬進行為期30 d的大蒜素補飼，對伊犁馬運動后即刻血液生化指標及免疫指標分析發現，以大蒜素補飼時間分組，隨著補飼時間的推進，測試賽賽后即刻血漿Ca2+、k+，乳酸出現降低現象，AST、ALT、LDH存在階段性上升趨勢，說明大蒜素的補飼時間長度對伊犁馬抗疲勞作用效果更明顯。

以大蒜素補飼量分組，隨著補飼量的增加，測試賽后即刻血漿AST、LDH出現升高趨勢，CK、CK-MB呈現下降趨勢，說明大蒜素的補飼量對伊犁馬抗疲勞作用效果明顯。免疫指標免疫球蛋白M、補體C4隨著補飼量的增加呈現明顯的升高趨勢，說明補飼劑量是大蒜素對伊犁馬免疫作用的主導因素。伊犁馬合理的大蒜素補飼量建議控制在300～500 mg/kg，對增強馬匹免疫力和改善馬匹抗疲勞能力效果良好。