超濾法測定鹽酸麻黃堿的血漿蛋白結合率

鮑慧瑋，徐 陽，劉芳馨

(1.長春中醫藥大學，吉林長春 130117；2.長春醫學高等?？茖W校，吉林長春 130000)

鹽酸麻黃堿[(1R，2S)-(-)-ephedrine hydrochloride](圖1)為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C. A. Mey.)或木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的活性物質，也是《中國藥典》(2015年版)中麻黃的質控指標之一[1]。由于化學結構與腎上腺素相似，麻黃堿具有擬腎上腺素樣作用，可用于支氣管哮喘、百日咳、枯草熱及其他過敏性疾病，能對抗脊椎麻醉引起的血壓降低、擴大瞳孔，也用于重癥肌無力、痛經等疾患，還可作中樞神經系統興奮劑[2-4]。

藥物的血漿蛋白結合率是影響藥物發揮藥效的重要因素，是研究藥物代謝動力學、藥物作用機制等方面的參數依據[5-6]。鹽酸麻黃堿的藥理作用廣泛，而文獻中未曾報導過對鹽酸麻黃堿血漿蛋白結合率測定的研究，故本實驗采用超濾法結合HPLC法[7-8]對鹽酸麻黃堿與小鼠、大鼠、家兔血漿蛋白結合率的測定進行研究，以期為其更準確的臨床應用提供依據。

圖1 鹽酸麻黃堿的化學結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-2030型高效液相色譜儀(日本島津公司)；TGL-16B臺式高速離心機(湖南星科科學儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；SK-1快速混勻器(江蘇金壇市江南儀器制造廠)；DT5001型電子稱(常熟市意歐儀器儀表有限公司)；AB135-S型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；Millipore 10K型超濾管(美國Millipore公司)。

鹽酸麻黃堿(批號：171237-200807，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇(色譜純，美國Fisher公司)；純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純，北京化工廠)。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，體重200±20 g；昆明種小鼠，體重20±2 g；家兔，體重2.0±0.5 kg(合格證號：SCXK(吉)-2016-0003、SCXK(吉)-2016-0004，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司)。

小鼠、大鼠、家兔分別采用摘眼球、眼眶、耳緣靜脈方式取血，置肝素潤洗的離心管中，4000 r·min-1離心10 min，分離血漿，置4℃冰箱中備用。

1.3 溶液的配制

1.3.1 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的配制

取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得pH為7.4的PBS溶液。

1.3.2 對照品溶液的配制

稱取鹽酸麻黃堿約25 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，制得質量濃度為5.036 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿對照品儲備液；再精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得質量濃度為0.5036 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿對照品溶液。

1.3.3 血漿樣品溶液的處理

取已配制好的對照品溶液，分別精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，再取新鮮血漿900 μL加入上述溶液中(PBS溶液補足體積至1000 μL)，渦旋震蕩，制得低、中、高3種濃度的鹽酸麻黃堿血漿樣品溶液，置37℃水浴2 h。分別吸取鹽酸麻黃堿血漿樣品溶液500 μL至超濾管中，6000 r·min-1離心20 min，即得不同濃度的血漿樣品超濾液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件與專屬性考察

Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為甲醇∶0.1%磷酸溶液(15∶85，v/v)，體積流量為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃，檢測波長為210 nm，進樣量為20 μL。

吸取PBS溶液100 μL置EP管中，再加入新鮮血漿900 μL置37℃水浴2 h，按照1.3.3制得空白血漿超濾液。在上述色譜條件下進行測定，待測色譜峰峰形良好，與其它色譜峰分離度大于5.0，且無干擾，表明該方法專屬性良好。結果見圖2(以大鼠血漿為例)。

A.鹽酸麻黃堿對照品；B.大鼠血漿樣品超濾液；C.空白血漿超濾液圖2 鹽酸麻黃堿HPLC色譜圖

2.2 線性關系考察

精密吸取1.3.2對照品儲備溶液20 μL，至2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得濃度為50.36 μg·mL-1的對照品母液。分別移取對照品母液0.15、0.2、0.5、1、2、5 mL至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得一系列不同濃度的鹽酸麻黃堿對照品溶液。按照上述色譜條件進入檢測，記錄峰面積。以鹽酸麻黃堿質量濃度(c，μg·mL-1)為橫坐標，色譜峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，求得鹽酸麻黃堿的線性回歸方程為y=47920x-21732(r=0.9997)。結果表明，鹽酸麻黃堿質量濃度在1.511～50.36 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.3 精密度考察

取1.3.3中濃度大鼠血漿樣品超濾液，分別在不同日期、不同人員、不同儀器下進行測定，記錄色譜峰面積，計算鹽酸麻黃堿質量濃度。結果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿質量濃度的RSD值為1.77%，表明該方法精密度良好。

2.4 穩定性考察

取1.3.3中濃度大鼠血漿樣品超濾液，分別在0、2、4、6、8、12 h時于上述色譜條件下進行測定，記錄色譜峰面積。結果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿峰面積的RSD值為1.84%，表明該方法在12 h內穩定性良好。

2.5 重復性考察

分別取新鮮血漿6份，按照1.3.3制備中濃度大鼠血漿樣品超濾液，在上述色譜條件下進行測定，記錄色譜峰面積，計算鹽酸麻黃堿質量濃度。結果，大鼠血漿樣品超濾液中鹽酸麻黃堿質量濃度的RSD值為1.13%，表明該方法重復性良好。

2.6 超濾膜回收率試驗

取1.3.2中對照品溶液，分別精密移取10 μL、40 μL、100 μL于EP管中，加入PBS溶液至體積1000 μL，渦旋震蕩，可得濃度約為5 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1的鹽酸麻黃堿-PBS溶液，置于37℃水浴溫育2 h。分別精密移取500 μL至超濾管中，6000 r·min-1離心20 min，即得不同濃度的超濾液。對不同濃度的鹽酸麻黃堿-PBS溶液和超濾液分別進行測定，計算超濾膜回收率。結果，低、中、高濃度的膜回收率分別為(99.47±1.22)%、(96.44±0.83)%、(95.11±0.79)%，RSD值分別為1.23%、0.86%、0.83%，表明該方法準確度良好。

2.7 血漿蛋白結合率的測定

取1.3.3中不同濃度的血漿樣品超濾液，在上述色譜條件下進行測定，記錄色譜峰面積，并計算其血漿蛋白結合率。結果見表1。

其中，C超濾前為超濾前含藥物的PBS溶液的濃度；C超濾后為相應血漿樣品超濾液的濃度。

由表1結果可知，鹽酸麻黃堿與不同屬血漿的蛋白均屬于較弱結合。通過SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計學分析，鹽酸麻黃堿與不同屬血漿的蛋白結合率均無濃度依賴性，但不同屬血漿與鹽酸麻黃堿的蛋白結合率有顯著性差異(p<0.05)。

表1 不同屬血漿的蛋白結合率

3 討論

藥物經吸收進入血液后，一部分與血漿蛋白結合為結合型藥物，只有另一部分游離型的藥物才能發揮藥效。本文通過測定血漿中游離鹽酸麻黃堿的含量，來計算藥物與血漿的蛋白結合率。經分析，鹽酸麻黃堿與小鼠、大鼠、家兔血漿蛋白均具有較弱的結合，且與濃度不成比，在臨床應用中，需避免因競爭結合而引起的游離鹽酸麻黃堿濃度升高，為更合理用藥提供依據。

根據查閱的文獻，血漿蛋白結合率測定方法有平衡透析法、微透析法、超濾法、超速離心法、以光譜學為基礎的方法、高效親和色譜法、微量熱法等[9-11]。本文采用超濾法與HPLC法結合的方法，利用半透膜原理，設備簡單、操作方便、不受體積遷移和稀釋效應的影響，建立一種準確、速率高、成本低的方法實現血漿中游離藥物的快速分離。

超濾膜的吸附作用會影響血漿蛋白結合率的測定結果[12]。根據超濾膜吸附率的測定結果分析，濃度越高，吸附率也越大。為了排除吸附率的干擾，計算血漿蛋白結合率時，應用采用超濾膜吸附之后的實際濃度進行計算，結果更加準確。