小鼠骨髓源樹突狀細胞制備

王雪靜

（貴州省獸藥飼料監察所，貴陽 550003）

0 引言

1973年Steinman和Cohn首次分離出一類同巨噬細胞、粒細胞和淋巴細胞形態與功能不同的細胞，命名為樹突狀細胞(DCs)。其主要來源是骨髓CD34+多能造血干細胞，是體內唯一能直接激活初始T細胞的抗原提呈細胞(APC)[1]，是機體免疫的始動者及固有免疫和適應性免疫的橋梁。髓系樹突狀細胞通過血液與淋巴液從骨髓移動并分布到皮膚，后趨向淋巴組織啟動免疫反應。淋巴系樹突狀細胞是T細胞集聚區的固定哨兵，分布主要局限在胸腺髓質及淋巴結T細胞區，具有免疫調節和免疫耐受作用。

當抗原性物質侵入機體時，宿主體內的免疫系統會啟動一系列免疫防衛機制識別并清除病原體，特異性免疫應答啟動前，需要APC攝取、加工、處理抗原并將抗原信息提呈給免疫應答的淋巴細胞。主要組織相容性復合物（MHC）是一段基因密度高的染色體區段，是一種復雜且多態性高的遺傳系統。主要存在2個途徑即溶酶體途徑（MHC-Ⅱ類途徑）和胞質溶膠途徑（MHC-Ⅰ類途徑）。另外，還存在MHC非依賴性的抗原提呈途徑，稱為CD1分子提呈途徑。DCs的成熟經歷前體期、幼稚期及成熟期3個時期。開始由骨髓進入血液循環，隨后到達靶組織或器官，停留在潛在抗原物質出現位置，主要有MHC-I型和MHC-II型2種抗原提呈途徑。

成熟DCs生物學特征有：能有效活化初始T細胞，有效攝取和處理抗原，CD80和CD11c可作為成熟DCs的標志，成熟DCs能啟動免疫應答、釋放干擾素等細胞因子等。DCs能攝取抗原并將其加工處理成能夠被T細胞識別的多肽段。T細胞受體特異性識別抗原肽-MHC分子復合物，刺激T細胞活化，進而啟動胞內信號轉導，誘導細胞增殖和分化有關基因的表達。成熟T細胞主要包括CD4+T細胞（輔助T細胞）和CD8+細胞毒性T淋巴細胞（CTL）2個亞群。免疫應答中，輔助T細胞最先激活，并釋放細胞因子，激活巨噬細胞，誘導CTL成熟，促進細胞免疫應答，輔助B細胞產生抗體等。

樹突狀細胞主要來源有小鼠（或大鼠）脾臟、淋巴結、骨髓，人臍帶血、外周血等。該試驗制備的是小鼠的骨髓源樹突狀細胞（BMDCs）。實驗室高純度的小鼠骨髓樹突狀細胞的成功制備，為臨床上治療疾病奠定了基礎。

1 設備與材料

1.1 主要儀器設備

（1）倒置相差顯微鏡37XB，購自上海光學儀器廠。

（2）電子天平FA-N/JA-N，購自上海民橋精密儀器公司。

（3）二氧化碳培養箱，購自BB15德國賀利氏公司。

1.2 試驗材料

RPMI-1640（Invitrogen）、南美洲胎牛血清（Hyclone）、Mouse IFN-γ（R&D Systems）、Mouse IL-4（R&D Systems）、DMSO（Sigma）HEPES（Amresco）淋巴細胞分離液-小鼠（lympholyte-M）（上海普飛生物技術有限公司）

1.3 試驗動物

BALB/c雄性小鼠（6～8周齡）購自河北醫科大學實驗動物中心，飼養于河北農業大學實驗動物房，室溫（23±2） ℃，供給全價飼料，自由采食、飲水。

2 試驗方法

將小鼠脫頸處死，浸于75%的酒精中，無菌取其股骨，沖洗出其骨髓細胞，加入Tris-NH4Cl裂解液并室溫作用5 min，裂解紅細胞，用Hanks液沖洗2次，收集細胞。使用含10%胎牛血清，rmGM-CSF，IL-4的1640配成細胞懸液，接種在12孔培養板上，每孔1 mL，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養2～3 d。取出培養板，輕搖數次，棄去懸浮細胞，再緩慢加入1 mL1640完全培養液，輕晃數次，洗去殘留非貼壁細胞。保留貼壁細胞的培養板中加入1640培養液繼續培養，培養至第6天，半量換液并繼續培養2 d；第8天，收集懸浮細胞即為小鼠骨髓來源的樹突狀細胞（BMDCs）。

3 試驗結果

用倒置相差顯微鏡觀察并記錄形狀，結果表明：培養2～3 d時逐漸出現細胞集落，大部分貼壁，細胞逐漸增大而不規則；培養到4～5 d時，有部分BMDCs從集落上脫落懸浮于培養基中，有樹突狀形態的突起伸出；培養到6～7 d時，BMDCs逐漸從細胞集落上脫落，樹突狀形態明顯，分叉增多。見圖1。

培養7 d后，DCs已成熟，流式細胞儀檢測證明[2]，CD11c、CD80、MHC高表達，CD11c作為BMDCs特異性表面分子，證明小鼠骨髓來源的單個核細胞體外誘導培養可以獲得較高純度的BMDCs。其細胞表面分子表達狀況見圖2。

圖1 培養時間增加DCS的形態變化

圖2 細胞表面分子鑒定圖

負載FMDV VP1蛋白質的DC與T細胞按照1∶5的比例分別培養3、9、24、48 h后，收集共培養物上清液，用ELISA檢測各組中IFN-γ的含量。結果見圖3。

圖3 各組中IFN-γ含量對比圖

用SPSS軟件統計分析，共培養3 h后，負載VP1蛋白質的DC與T細胞共培養組產生IFN-γ的量與兩個對照組接近，差異不顯著（P＞0.05）；共培養9 h后，負載VP1蛋白質的DC與T細胞共培養組產生的IFN-γ分別與對照組DC+T和DC相比，含量明顯增高，差異極顯著（P＜0.01）；共培養24、48 h后，負載VP1蛋白質的DC與T細胞共培養組產生IFN-γ的量也高于對照組DC+T和DC，差異顯著（P＜0.05）。

由圖3可知，在負載VP1蛋白質的DC活化淋巴結T細胞過程中，T細胞釋放IFN-γ的量要明顯高于對照組，表明負載FMDV VP1蛋白的DCs能夠有效激活淋巴結T細胞，并表達高水平的IFN-γ，提取的DCs純度較高。

4 結論

樹突狀細胞有能力刺激初始T細胞，使其具有向細胞毒性T細胞轉化的功能，并介導腫瘤的清除；樹突狀細胞具有遷徙并浸入腫瘤的功能，因此可直接誘導潛在的T細胞發揮有效的免疫功能；樹突狀細胞可以同時提呈一系列不同抗原，引發全面的抗腫瘤免疫反應[3]。

對樹突狀細胞的研究，能更好的解決一些臨床疾病。如研究樹突狀細胞最適于腫瘤的免疫治療的類型，樹突狀細胞負載抗原能否適用于所有類型的腫瘤以及研究在臨床移植中，利用樹突狀細胞的細胞免疫及免疫耐受治療移植排斥及對抗病毒感染等。