貫筋藤酶解山羊乳酪蛋白糖巨肽的工藝研究

趙存朝，王雪峰，黃夢，魏光強，黃艾祥

（云南農業大學食品科學技術學院，昆明 650201)

0 引 言

貫筋藤（Dregea sinensis hemsl）為蘿藦科、南山藤屬植物，攀援木質藤本，俗稱“奶漿藤”[1]。生長于海拔500～3000米山地森林中或灌木叢中，在中國滇西北地區，長期以來用貫筋藤莖桿的熱水溶液加工乳餅，而不是常規的酸水做凝乳劑[2]。作者所在課題組通過國家基金項目-貫筋藤凝乳機理的研究（31160331）結果表明，貫筋藤蛋白酶對CN，α、β、κ-CN均有降解作用，α-CN部分降解，β-CN和κ-CN全部降解，是一種復合蛋白酶，主要是分子量23.8 ku的半胱氨酸蛋白酶procerain B，該酶具有耐高溫、耐酸堿性能較好、凝乳活力較高等酶學特性[3-5]；通過MALDI-TOF質譜儀測定酶切肽段的分子量、蛋白多肽序列測序儀測定氨基酸序列，確定κ-CN的酶切位點為Ala90-Glu91，產生分子量分別12 ku的副κ-酪蛋白和6.9 ku的CGMP；且不同于大多數凝乳酶的酶切位點Phe105-Met106[6]。

1 實驗

1.1 材料與試劑

山羊乳，貫筋藤凝乳酶（由實驗室提供[3-6]）酶活力為223.135 SU/mL。牛血清蛋白，唾液酸；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

URA14M 0018分光光度計，RE-52AA旋轉蒸發儀，TGL20M高速冷凍離心機，HWS24型水浴鍋，DYY-6C電泳儀，Bro-rid伯樂垂直電泳槽。

1.3 方法

1.3.1 山羊乳CGMP粗提工藝流程

山羊乳脫脂（3 040 g、離心10 min）→酶解→滅酶（沸水浴10 min）→離心（3 040 g離心20 min）→20%的硫酸銨鹽析→離心（10 000 g離心10 min）→ 透析脫鹽（分子量為500～1 000 u的透析袋）→ 冷凍干燥（5～10 MPa，-50℃）→CGMP粗品。

1.3.2 酶解制備CGMP單因素工藝篩選

那天午后，知了在樹上嘰嘰喳喳地叫著，我對著天空，呆呆地望著它，媽媽見我這樣，急忙想出一個好點子，我們去圖書館吧！我像一只被放出籠子的小鳥一樣，沖到了圖書館。

以貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳后酶解液的水解度和CGMP含量為指標?？疾烀附鈺r間（20，30，40，50，60 min），酶解溫度（70，75，80，85，90℃），酶的添加量（以脫脂山羊乳體積的4%，5%，6%，7%，8%，9%）對山羊乳酶解液水解度和CGMP質量濃度的影響，確定貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳的最佳因素水平。

1.3.3 山羊乳源CGMP提取工藝響應面實驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用響應面Box-Behnken實驗設計，選取酶解時間、酶解溫度、酶的添加量3個因素，進行3因素3水平的試驗設計，優化貫筋藤蛋白酶提取山羊乳源酪蛋白糖巨肽的工藝參數。響應面分析因素及水平如表1所示。

表1 響應面實驗因素與水平設計

式中：h為單位質量蛋白質中被水解的肽鍵的量（mmol/L）；htot為單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmol/L），乳酪蛋白濃度為htot=8.2 mmol/L；B為水解過程中的耗堿量(mL)；Nb為堿液濃度（mol/L）；MP為水解液中蛋白質質量（g）；a為校正系數（設貫筋藤蛋白酶=1）。

（2）CGMP質量濃度測定[10]。κ-酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質，而唾液酸（N-乙酰神經氨酸）都集中在CGMP上，所以可以用測定唾液酸含量的大小鑒定CGMP生成量的多少。配制3.26 mmol/L的唾液酸標準溶液，分別取不同濃度的標準溶液2 mL，加入間苯二酚試劑工作液2 mL（2%的間苯二酚溶液10 mL，加入濃度為0.1 mol/L的硫酸銅溶液0.25 mL，加入濃鹽酸80 mL，用蒸餾水定容至100 mL，

1.3.4 山羊乳酶解液中CGMP的檢測

（1）水解度測定[15]。水解度的測定采用p H-stat法，水解度的計算公式為置于室溫4 h后4℃儲存）至具塞試管中，加蓋置于沸水浴中加熱15 min，然后快速冷卻，加有機溶液乙酸丁酯-正丁醇（85：15）4 mL，振蕩提取后在37℃下水浴5 min，4℃(2 860 g)轉速離心10 min，取上層有機相，于波長580 nm處測定吸光值。繪制標準曲線回歸方程為：y=1.4141x+0.0409（0.1008～0.6048 mg/mL，R2=0.999；y為吸光度，x為唾液酸標準液濃度。取樣品溶液2 mL，參照標準曲線制作方法測定水解液吸光值。

式中：A580為水解液吸光度；V1為水解液體積；V2為山羊奶體積。

（3）CGMP純度測定[16]。采用紫外吸收法測酪蛋白糖巨肽的濃度。CGMP的化學特征為不含芳香族氨基酸，只有205 nm～217 nm處的紫外吸收，在280 nm處沒有紫外吸收。因此，210 nm與280 nm處的紫外吸收差值可用于CGMP純度的評價。本實驗測定山羊乳酶解液超濾后不同分子量的CGMP粗品的純度。

式中：OD210-210 nm吸光度；OD280-280 nm吸光度。

（4）蛋白質測定采用考馬斯亮藍比色法[17]。

（5）CGMP的糖基化度[18]。CGMP的功能性成分是唾液酸，CGMP片段中唾液酸含量與蛋白質含量的比值越大，則糖基化度越大。糖基化度為間苯二酚-鹽酸法測定唾液酸在580 nm處的吸光度與水解液中蛋白含量的比值。

1.3.5 理化指標測定

（1）水分質量分數測定根據GB 5009.3-2016中的直接干燥法進行；（2）脂肪分數測定根據GB 5413.3-2010中的相關方法進行；（3）蛋白質質量分數測定根據GB 5009.5-2010中的凱氏定氮法，對蛋白質質量分數進行測定；（4）灰分測定根據GB 5009.4-2016中的相關方法進行。

1.4 數據處理

采用Excel 2013對實驗數據進行整理，利用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析、利用spss24對數據進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 酶解制備CGMP單因素實驗

以貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳溫度（70，75，80，85，90℃），時間（20，30，40，50，60 min），酶的添加量（4%，5%，6%，7%，8%，9%）為考察因素，對脫脂后的山羊乳進行酶解，4 000 g離心20 min；離心后取上清液，測定其水解度及唾液酸質量濃度，結果如圖1所示。

圖1 酶解因素對水解度及唾液酸質量濃度的影響

圖1 中，所有的值表示為平均值±標準差（X±SD；n=3）；CGMP質量濃度及水解度曲線上具有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。

由圖1可以看出，山羊乳酶解液水解度及唾液酸質量濃芳隨著酶解溫度的提高呈先上升后下降趨勢；酶解液水解度及唾液酸質量濃度85℃是顯著高于其他酶解溫度，分別為19.68%和2.846 mg/mL（P＜0.05）；實驗過程中，發現隨著溫度的提高，山羊乳的凝乳時間在縮短，且85℃時山羊乳5 min內凝乳，凝乳時間較短；原因可能是：凝乳發生時總的κ-酪蛋白被水解掉約80%后，在鈣離子與酪蛋白膠粒間形成化學鍵形成凝塊或凝固的乳，使部分CGMP不能測定出來，造成CGMP含量及水解度下降[19]。

隨著時間增加山羊乳酶解液唾液酸含量呈上升后下降的趨勢；酶解液唾液酸含量在酶解30 min時顯著高于其他酶解時間，2.661 mg/mL（P＜0.05）；隨著時間的延長，水解度隨時間增加呈上升趨勢。原因可能是：隨時間延長導致除CGMP外的非目標肽增加，水解度不斷提高，但30 min時酶解液中CGMP含量最高，故選擇30 min為最佳酶解時間。

隨著酶添加量的增加，山羊乳酶解液水解度及其中唾液酸含量呈上升趨勢；當酶的添加量超過7%時水解度趨近于平緩，差異不顯著，酶的添加量超過6%時CGMP含量趨近于平緩，差異不顯著（P＜0.05）；酶的添加量達到7%時，山羊乳酶解液水解度及CGMP含量最大，故選取7%為酶解最適添加量。原因可能是：隨著酶的添加量提高，酪蛋白膠粒表面的κ-酪蛋白分子層部分分解，內部的α，β-酪蛋白失去膠體保護作用也會被貫筋藤凝乳酶水解，所以山羊乳酶解液水解度會隨之提高，所以內層酪蛋白在很短時間內會和貫筋藤蛋白酶發生反應，自然會引入非目標肽類，所以本實驗不能使酶解反應無限制的進行[20]。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據單因素試驗結果，建立Box-Behnken Design中心組合設計試驗模型，通過擬合二次方程計算最優工藝組合以及山羊乳CGMP的最大理論提取量。選擇酶的添加量（X1）、酶解溫度（X2）、酶解時間（X3）進行三因素三水平響應面試驗，實驗結果如表2所示。

表2 響應面分析方案及結果

2.2.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2進行多元回歸擬合，得到羊乳酶解液水解度、唾液酸含量與酶的添加量（X1）、溫度（X2）、時間（X3）的二次方程模型為：Y1=18.87+1.21X1+0.62X2+0.75X3+0.6X1X2－0.17X1X3－0.53X2X3－1.78X12－1.71X22+0.11X32；Y2=3+0.13X1－ 0.074X2+0.014X3+0.028X1X2－（3.75×10-3）X1X3－0.14X2X3－0.45X12－0.42X22－0.53X32。回歸模型的方差分析結果如表3所示。

由表3方差分析可知：山羊乳乳清水解度回歸模型顯著性檢驗P＜0.0001＜0.05，乳清中唾液酸質量濃度回歸模型顯著性檢驗P＜0.0001＜0.05，說明兩者二次多元回歸模型極顯著；山羊乳乳清水解度回歸模型失擬性檢驗P=0.7716＞0.05，唾液酸質量濃度回歸模型失擬性檢驗P=0.1027＞0.05，可以認為所選水解度及CGMP質量濃度二次回歸模型與實際試驗擬合性充分模型失擬不顯著。水解度回歸診斷表明，決定系數R2=0.9746，信噪比Adeq precisior=14.764，唾液酸質量濃度回歸診斷表明，決定系數R2=0.9865，信噪比Adeq precisior=18.532。這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于預測山羊乳乳清的水解度及唾液酸的提取質量濃度。離散系數C.V（Y的變異系數）表示實驗本身的精確度，C.V值越小，實驗的可靠性越高，水解度擬合C.V值為2.47%，唾液酸質量濃度過C.V值為3.45%。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，實驗誤差小，能夠準確的分析和預測山羊乳酶解液的水解度及唾液酸的提取量，說明實驗操作可信度高，具有一定的實踐指導意義。由回歸系數顯著性表明，在所取因素水平范圍內，各因素對山羊乳水解度影響的順序為：酶的添加量＞酶解時間＞酶解溫度；各因素對山羊乳乳清唾液酸含量影響的順序為：酶的添加量＞酶解溫度＞酶解時間。

表3 水解度及唾液酸含量回歸模型方差分析結果

2.2.3 響應面分析結果

圖2和是通過二次回歸模型擬合的響應面變化三維曲面。響應面和等高線的稀疏程度可直觀地反映溫度℃、時間min、酶的添加量%之間交互作用對山羊乳蛋白水解度%及其中唾液酸質量濃度的影響，當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著。

由圖2可以看出：隨著時間的延長山羊乳水解度呈上升趨勢，而溫度的不斷上升使山羊乳水解度呈先上升后下降趨勢，與單因素實驗結果一致，表4方差分析顯示，貫筋藤酶解溫度與酶解時間交互作用顯著，P=0.0252＜0.05；隨著貫筋藤蛋白酶添加量與溫度的提高，山羊乳水解度呈先上升后下降的趨勢，表4方差分析顯示，貫筋藤蛋白酶的添加量與溫度交互作用顯著，P=0.042＜0.05；固定酶的添加量為0水平，隨著時間及酶解溫度的提高山羊乳酶解液中CGMP質量濃度呈先上升后下降的趨勢，表3方差分析顯示，酶解時間與溫度交互作用顯著，P=0.0107＜0.05；二次回歸模型擬合結果顯示，酶的添加量7.24%，時間達31.76 min，酶解溫度為85.21℃時，山羊乳清水解度及唾液酸含量響應曲面出現最高點，水解度預測值19.21%，唾液酸質量濃度預測值2.991 mg/mL。

圖2 各因素交互作用對山羊乳水解度及唾液酸質量濃度影響的響應面

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

回歸模型通過響應面法得到最優山羊乳清水解度及唾液酸含量的工藝條件，為驗證該模型的預測是否準確，考慮實際操作情況的方便性與設備參數狀況，確定貫筋藤蛋白酶酶解山羊乳最佳工藝條件為：酶的添加量7%，酶解溫度85℃，酶解時間32 min，在此條件下進行6次重復實驗，結果表明水解度為21.19%±0.46%，CGMP質量濃度為（2.821±0.0331）mg/mL，與預測值接近，說明模型準確可靠。山羊乳在酶解過程中凝乳狀態良好，水解穩定。

2.3 山羊乳源CGMP的檢測

配制質量濃度為5 mg/mL的山羊乳CGMP凍干粉粗品，對其進行檢測，實驗結果如表4所示。

表4 山羊乳CGMP檢測

2.4 理化指標測定

相關理化指標結果如表5所示。

表5 山羊乳CGMP理化指標測定 %

3 結 論

（1）實驗以貫筋藤蛋白酶、山羊乳為材料，利用酶法對山羊乳源CGMP的提取工藝進行優化，重點分析酶解因素作用規律，通過響應面試驗Box-Behnken設計優化了貫筋藤酶解山羊乳源CGMP的最佳提取工藝。

（2）利用貫筋藤酶解山羊乳制備的CGMP具有較高的糖基化度及純度，為提高山羊乳資源的綜合利用水平，生物活性制劑、保健食品、醫藥品的開發提供了理論依據。