一株降膽固醇乳酸菌的篩選及其在模擬消化環境活性的研究

范穎，陳思涵 ，黨芳芳，王喆，滿朝新，姜毓君,b

（東北農業大學a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.國家乳業工程技術研究中心，哈爾濱 150030）

0 引 言

近年來，心血管疾病的發病率逐年攀升[1]，據報道，心血管疾病是全球的首要死因，每年死于心血管疾病的人數多于其他任何死因[2]。相比血脂正常人群，高膽固醇血癥人群發生心血管疾病的危險性高出3倍以上[3]。乳酸菌作為重要的益生菌被證實有多種益生功能，其中，其益生功能之一降低血清總膽固醇得到廣泛研究[4-5]。

本研究從實驗室保藏及分離自西藏地區傳統乳制品的25株乳酸菌中篩選出一株能高效降膽固醇的植物乳桿菌，對其在模擬消化環境中活性進行研究，為后續開發降膽固醇發酵乳提供理論基礎作為參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

分離自西藏地區傳統乳制品：干酪乳桿菌TD 085，TD086，TD088；植物乳桿菌TD112，TD113，TD 114；乳明串珠菌TD115，TD116，TD117；羅伊氏乳桿菌TD118和TD119；保加利亞乳桿菌TD121，TD122，TD123。

實驗室保藏：干酪乳桿菌ATCC 393；副干酪乳桿菌 TD102，TD103，TD104；短 乳 桿 菌 TD 107和TD 108；植物乳桿菌TD109，TD110，TD111；嗜酸乳桿菌ATCC 11975和NCFM。

1.1.2 培養基及主要試劑

MRS液體培養基：蛋白胨5.0 g、胰蛋白胨10 g、牛肉膏5.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、檸檬酸氫二銨2.6 g、磷酸氫二鉀2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳0.25 g、Tween-80 1 mL，加水至1 000 mL，pH調至5.8，121℃滅菌15 min，4℃保存。

MRS-CHOL-THIO培養基：MRS液體培養基中加0.25%巰基乙酸鈉、質量濃度為100μg/mL膽固醇以及0.35 g/100 mL膽鹽，121℃滅菌20 min，4℃保存。

膽固醇，膽鹽，巰基乙酸鈉，鄰苯二甲醛，體積分數為95%乙醇，氫氧化鉀，正己烷，鹽酸，氯化鈉，胃蛋白酶，胰蛋白酶，碳酸氫鈉，均為分析純。

1.1.3 主要儀器和設備

DHP-9272型電熱恒溫培養箱，BCN 1360型生物潔凈工作臺，低溫冷凍離心機，高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 降膽固醇菌株篩選

1.2.1.1 膽固醇標準曲線

分別取質量濃度為10，20，30，40，50，60μg/mL的膽固醇溶液1 mL，60℃氮吹揮發盡溶劑，加入質量濃度為0.5 mg/mL的鄰苯二甲醛溶液2 mL，緩慢加入濃硫酸1 mL，充分振蕩混勻后，室溫下顯色10 min，于波長550 nm測定吸光值。以膽固醇的質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作膽固醇標準曲線。

1.2.1.2 膽固醇脫除率測定

將25株菌活化兩代后分別以2%的接種量接種至MRS-CHOL-THIO培養基，培養24 h后，分別將菌液于4℃，5 000 rpm離心10 min，取上清液1 mL于干凈試管中，加入95%乙醇4 mL和質量分數為33%的氫氧化鉀溶液3 mL，混勻后，60℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，加入正己烷7 mL，混勻后加入4 mL蒸餾水，漩渦振蕩后室溫靜置至分層。取3 mL上層正己烷層，60℃氮吹揮發盡溶劑，加入5 mL鄰苯二甲醛溶液，混勻后靜置10 min，緩慢加入3 mL濃硫酸，立即混勻，靜置10 min后，于波長550 nm處測定吸光值。根據標準曲線的回歸方程計算膽固醇質量濃度，并利用公式計算膽固醇脫除率，即

膽固醇脫除率=（1－C1/C0）×100%，

式中：C1為菌株接至MRS-CHOL-THIO培養24 h后上清液中膽固醇的質量濃度；C0為開始培養之前培養基中膽固醇的質量濃度。

1.2.2 環境耐受性實驗

1.2.2.1 耐酸性實驗

菌株于37℃在MRS培養基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于用濃度為4.0 mol/L的HCL調整后p H值為3.0和2.0的MRS培養基中，37℃，分別作用0，1，2，3 h后取菌液；10倍稀釋涂布于MRS固體培養基，設3個平行，進行菌落計數，以MRS培養基（pH=5.8）中培養的菌落數為對照，計算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為低pH值MRS培養基中活菌數；N0為pH值為5.8時MRS培養基中活菌數。

1.2.2.2 耐膽鹽實驗

菌株于37℃在MRS培養基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于膽酸鹽質量分數分別為0.3%，0.5%，1%的MRS培養基；分別作用0，1，2，4 h后取菌液；10倍稀釋涂布于MRS固體培養基，設3個平行，進行菌落計數，以MRS培養基中培養的菌落數為對照，計算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為含不同分數膽鹽MRS培養基中活菌數；N0為MRS培養基中活菌數。

1.2.2.3 耐鹽實驗

菌株活化兩代后，以2%接種量分別接種至NaCl質量濃度分別為0～7 g/100 mL的MRS培養基中，37℃培養24 h后取菌液，10倍稀釋涂布于MRS固體培養基，設3個平行，進行菌落計數，以MRS培養基中培養的菌落數為對照，計算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為含不同質量濃度NaCl培養基中活菌數；N0為MRS培養基中活菌數。

1.2.2.4 人工胃液和人工腸液耐受性實驗

菌株于37℃在MRS培養基中活化兩代后制備菌懸液，重懸于人工胃液（質量分數為0.35%胃蛋白酶、質量分數為0.3%的NaCl，調整至p H值為3.0，過濾除菌）中，37℃處理0，1，2，3后取菌液，進行菌落計數。之后，取處理3 h后含菌的人工胃液，以2%接種量接種于人工腸液（質量分數1.1%碳酸氫鈉、0.3%Na-Cl、0.1%胰蛋白酶、0.6%膽鹽，調整至p H值為 8.0，過濾除菌）中，37℃處理0，3，5，7，8 h后取菌液；進行菌落計數，以MRS培養基中培養的菌落數為對照，計算存活率，即

存活率=Nt/N0，

式中：Nt為人工胃腸液中活菌數；N0為MRS培養基中活菌數。

2 結果與分析

2.1 降膽固醇能力測定

2.1.1 膽固醇標準曲線

圖1是膽固醇標準曲線，線性方程是：y=0.0074x+0.0044，R2=0.9951，線性關系良好，可用于降膽固醇能力的測定。

圖1 膽固醇標準曲線

2.1.2 不同菌株降膽固醇能力比較

通過鄰苯二甲醛法測定25株乳酸菌對膽固醇脫除率，結果如圖2所示。圖2中，膽固醇脫除率小于20%有5株菌，膽固醇脫除率20%～30%有11株菌，膽固醇脫除率30%～40%有6株菌，膽固醇脫除率大于40%有3株菌：植物乳桿菌TD109，植物乳桿菌TD113，嗜酸乳桿菌NCFM，對膽固醇脫除率分別為47.89%，43.39%，40.63%，其中，植物乳桿菌TD109膽固醇脫除率最高，與居華[6]、丁苗[7]分離出的菌株相比，脫除率相對較高，因此植物乳桿菌TD109被篩選出用于后續研究。

圖2 實驗菌株膽固醇脫除率

2.2 耐酸性實驗

菌株能順利定植腸道的前提條件是可耐受胃中的酸性環境，胃液的p H值會隨著飲食的攝入與排空發生不斷變化。在空腹時，胃液的p H值為0.9～1.8；在攝入食物后，胃液p H會隨飲食結構變化，約為1.8～5.0，通常會維持在pH值3.0左右[8]。食物在胃中的停留時間通常為1～3 h[9]。因此，本實驗選取2個不同pH（2.0和3.0），在作用0，1，2，3 h分別取樣，進行菌落計數，檢測菌株對酸的耐受性，結果如圖3所示。由圖3可以看出，植物乳桿菌TD109在pH值為2.0條件下耐受性較差，處理1 h后，菌落總數明顯下降，處理2 h后，活菌數為0；在p H值為3.0條件下有較強耐受性，隨著處理時間增長，菌落總數下降緩慢，在處理3 h后活菌數仍達到108mL-1。由此說明，植物乳桿菌TD109有耐受胃酸環境的能力。

圖3 植物乳桿菌TD109對酸的耐受性

2.3 耐膽鹽實驗

小腸中存在一定濃度的膽鹽，菌株要想在在小腸中發揮益生作用，需耐受一定濃度的膽鹽。通常人體小腸內的膽鹽濃度約為0.3%（w/v）[10]。本實驗選取3個不同質量分數的膽鹽（0.3%，0.5%，1%），在處理0，1，2，4 h后分別取樣，進行菌落計數，檢測菌株對膽鹽的耐受性，結果如圖4所示，由圖4可以看出，植物乳桿菌TD109有較強的耐膽鹽能力，在3個不同濃度作用下，隨著時間增長，菌落總數下降緩慢，在質量分數為1%膽鹽處理1，2，4 h后，存活率分別為51.04%，36.77%，24.06%。可見，植物乳桿菌TD109有耐受膽鹽能力。

圖4 植物乳桿菌TD109對膽鹽的耐受性

2.4 耐鹽實驗

隨著飲食變化，體內離子濃度會發生變化，從而改變人體滲透壓。微生物在等滲溶液中適合生長，在低滲溶液中，無細胞壁的細胞會發生水溶現象，溶液進入細胞，使細胞膨脹破裂死亡[11]，而植物乳桿菌作為革蘭氏陽性菌，有較厚的富有韌性的細胞壁，不會出現膨脹至破裂的現象，故低滲環境對其影響不大；在高滲溶液中，微生物會發生質壁分離[12]，嚴重失水，水分是微生物生長非常必要的條件，失水會抑制微生物生長。人體胃腸道中NaCl質量濃度范圍為1～4 g/100 mL[13]。本實驗，將植物乳桿菌TD109分別接入含有NaCl質量濃度0～7 g/100mL的MRS培養基中進行培養，菌落計數，檢測菌株耐鹽能力，結果如圖5所示。由圖5可以看出，在人體胃腸道中常規NaCl質量濃度4 g/100mL條件下，植物乳桿菌TD109存活率為4.72%。雖然活菌數隨NaCl濃度增加而降低，但在NaCl質量濃度7 g/mL的高鹽濃度下，菌落總數仍可達到107mL-1以上。可見，植物乳桿菌TD109有耐高鹽環境的能力。

圖5 植物乳桿菌TD109對NaCl的耐受性

2.5 耐人工胃液實驗

人體胃液呈酸性，胃蛋白酶在酸性環境中被激活，可能會殺死進入胃中的細菌[14]。益生菌要想在胃中發揮作用，就要有對酸性和胃蛋白酶的耐受性。本研究選取通常情況下胃中pH值為3.0的條件下[8]，在人工胃液中檢測菌株的耐受性，結果如圖6所示。由圖6可以看出，在人工胃液處理1，2，3 h后，植物乳桿菌存活率分別為50.22%，35.72%，13.41%。由此可見，植物乳桿菌TD109對人工胃液有較強的耐受性。

圖6 植物乳桿菌TD109對人工胃液的耐受性

2.6 耐人工腸液實驗

食物經過胃消化后會進入腸道，腸道中的菌群生長受腸道中多種成分的影響，菌株要想在腸道中發揮作用，要有耐受小腸中胰蛋白酶及堿性環境的能力。小腸中pH值約為7.6，一般食物在小腸中停留時間為3～8 h[14]。本研究選取pH值為8.0的人工腸液處理不同時間，通過菌落計數檢測植物乳桿菌TD109對人工腸液的耐受性，結果如圖7所示。由圖7可以看出，植物乳桿菌TD109在人工腸液處理3，5，7，8 h后，存活率分別為79.26%，60.37%，50.84%，47.66%。可見，植物乳桿菌TD109有耐受人工腸液的能力。

圖7 植物乳桿菌TD109對人工腸液的耐受性

3 結論

本研究對25株乳酸菌進行體外降膽固醇能力比較，結果表明，大部分菌株膽固醇脫除率在20%～30%，其中有3株乳酸菌膽固醇脫除率在40%以上，體外降膽固醇能力最強的是植物乳桿菌TD 109，膽固醇脫除率為47.89%。

通過對酸、膽鹽、鹽、人工胃液和人工腸液的耐受性實驗研究發現，植物乳桿菌TD 109在p H值為3.0條件下處理3 h后菌落總數仍可達到108mL-1以上；在1%膽鹽處理4 h后存活率可達24.06%；在7 g/100mL的高鹽質量濃度下培養后，菌落總數可達到107mL-1以上；植物乳桿菌TD109可順利通過胃的消化后進入腸道，在人工腸液處理8 h后存活率可達47.66%。

由以上結果可見，植物乳桿菌TD109有體外降膽固醇的能力，并且有較強的環境耐受能力，為后續進一步研究植物乳桿菌TD109降膽固醇機制研究提供依據。