長(zhǎng)非編碼RNA H19在結(jié)直腸癌化療敏感性中的作用研究

王秀梅 趙海平 秦瓊 劉永強(qiáng) 張兵 武永勝

結(jié)直腸癌是發(fā)病率較高的腸癌之一，據(jù)研究調(diào)查顯示，男性結(jié)直腸癌發(fā)病占惡性腫瘤發(fā)病率第三位、女性結(jié)直腸癌發(fā)病率居第二位。同其它惡性腫瘤一樣，結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展是環(huán)境和基因交互作用的結(jié)果，確切發(fā)生機(jī)制目前未完全闡明，研究顯示，大部分早期結(jié)直腸癌患者能通過(guò)手術(shù)治愈，但患者早期不易發(fā)現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)往往已被診斷為結(jié)腸癌晚期，導(dǎo)致化療效果較差，其預(yù)后情況不盡人意［1-3］。但有效的分子標(biāo)記物缺乏及放化療帶來(lái)的副作用，致使化療效果并不理。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是200 bp以上且不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA［4-5］，雖不能編碼蛋白質(zhì)，但lncRNA具有諸多生物學(xué)作用如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、修飾組蛋白等，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布。隨著基因芯片等技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的lncRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展存在密切聯(lián)系，在結(jié)直腸癌的作用機(jī)制逐漸清晰［6］。目前仍不清楚lncRNA 對(duì)結(jié)直腸癌的化療效果影響［7］，H19 基因位于人染色體11p15.5，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程，研究表明 H19 在結(jié)直腸癌中可能具有癌基因和抑癌基因的雙重作用［8-9］。但目前尚未有資料研究H19基因?qū)Y(jié)直腸癌化療敏感性的影響。本研究擬探討H19基因調(diào)控結(jié)直腸癌化療敏感性機(jī)制。

資料和方法

一、主要材料和試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo來(lái)自于中科院上海細(xì)胞所。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自GIBCO 公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購(gòu)自Introgen（美國(guó)）公司；lncRNA H19 引物由上海生工生物合成。MDR1、MRP1、BCRP、bcl-2、bax等抗體均購(gòu)自CST公司。選取2017年1～12月本院腫瘤科26例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織，患者年齡43～78 歲，平均（63.65±14.17）歲，其中男 15 例，女11 例。標(biāo)本全部經(jīng)專業(yè)病理科人員指導(dǎo)采集并經(jīng)病理切片證實(shí)。

二、方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

在 RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、90% 濕度孵箱中貼壁培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo。根

據(jù)脂質(zhì)體2000操作說(shuō)明，將脂質(zhì)體2000分別將H19siRNA、pcDNA-H19質(zhì)粒及陰性對(duì)照載體轉(zhuǎn)染至LoVo細(xì)胞，構(gòu)建lncRNA H19穩(wěn)定過(guò)表達(dá)及表達(dá)沉默的結(jié)腸癌細(xì)胞株。

（二）MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性

各組分別加100 μL細(xì)胞至96孔板中。 每組加入5-Fu使終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64、132 g/mL，各組細(xì)胞各個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄去培養(yǎng)液，再加入150 μL二甲基亞砜，震蕩10 min，于自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處吸光度值。根據(jù)公式：抑制率=（1－實(shí)驗(yàn)組平均 A值/對(duì)照組平均A 值）×100%，根據(jù)抑制率計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

（三）劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)，在培養(yǎng)孔垂直方向用槍頭輕輕劃過(guò)貼壁細(xì)胞層。用PBS洗去脫落細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、48 h時(shí)在顯微鏡下對(duì)劃痕拍攝，計(jì)算距離。

（四）RT-qPCR檢測(cè)lncRNA H19表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用TaqMan@MicroRNA Reverse Transcription kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反 應(yīng) 總 體 系 為 10 μL。 用 TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR試 劑 盒 檢 測(cè)lncRNA H19表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)標(biāo)，lncRNA H19 F：5’-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3’；R：5’-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3’；β -actin F：5’- CCTGTACGCCAACACAGTGC - 3’；β-actin R：5’- ATACTCCT GCTTGCTGATCC -3’； 每組設(shè)三個(gè)重復(fù)，根據(jù)△△CT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析，根據(jù)各樣本的平均Ct 值，以 2-ΔΔCt表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平，所有反應(yīng)均在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀完成。

（五）Western blot

根據(jù)蛋白提取試劑盒操作步驟提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白總量。根據(jù)目的蛋白分子量，用合適濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離，繼而轉(zhuǎn)膜和封閉，稀釋一抗后放置在4 ℃冰箱過(guò)夜；用TBST洗滌3次，二抗孵育60 min后繼續(xù)TBST洗滌3次，化學(xué)發(fā)光后采集圖像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)SPSS l9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用t檢驗(yàn)計(jì)算兩組間差異，單因素方差分析計(jì)算多組間差異，P＜0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)26例結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)的旁癌正常組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)水平。與旁癌組織相比，結(jié)直腸癌組織中l(wèi)ncRNA H19的相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 lncRNA H19在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

二、lncRNA H19轉(zhuǎn)染效果

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，H19siRNA轉(zhuǎn)染后lncRNA H19表達(dá)顯著降低（P＜0.05），pcDNA-H19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后lncRNA H19表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），空白對(duì)照無(wú)明顯變化。提示轉(zhuǎn)染效果良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

三、結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo對(duì)5 -FU的化療敏感性差異

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組LoVo細(xì)胞IC50為（52.31±4.32）μg/mL， 過(guò) 表 達(dá) lncRNA H19后，IC50為（98.32±9.32）μg/mL， 提 示lncRNA H19上調(diào)可導(dǎo)致LoVo對(duì)5-FU的敏感性降低。干擾lncRNA H19 LoVo IC50為（31.21±2.12）μg/mL，提示lncRNA H19下調(diào)可導(dǎo)致LoVo對(duì)5-FU的敏感性增加。見圖3。

四、細(xì)胞遷移能力

圖2 lncRNA H19轉(zhuǎn)染

圖3 結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo對(duì)5-FU的化療敏感性

劃痕后48 h時(shí)，H19過(guò)表達(dá)后LoVo細(xì)胞的劃痕距離比陰性對(duì)照組（negative control，NC）大，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.542，P＜0.01）。H19干擾后LoVo細(xì)胞的劃痕距離比NC細(xì)胞小，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)意義（t=5.613，P＜0.01），見圖4。

五、Western blot檢測(cè)凋亡及耐藥蛋白水平

Western blotting 檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對(duì)凋亡蛋白BCL-2、Bax；耐藥蛋白MDR1、MRP1和BCRP表達(dá)，結(jié)果顯示H19過(guò)表達(dá)后LoVo細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表達(dá)上調(diào)，H19干擾后Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表達(dá)下調(diào)，見圖5。

討 論

近期諸多研究證實(shí)，多種LncRNA在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［10］。目前發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌相關(guān)的主要LncRNA主要有H19、結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1、UCA1等。H19通過(guò)miRNA675和靶向蛋白質(zhì)發(fā)揮作用［11-13］。5-FU作為結(jié)腸癌患者的一線化療用藥，其毒性較低，且抗腫瘤活性持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)［14-16］。但隨著持續(xù)用藥，患者對(duì)5-FU逐漸產(chǎn)生耐藥性，化療藥物逐漸變得無(wú)效。深入研究H19表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者耐藥的調(diào)控機(jī)制，可能為提高臨床療效提供支持［17］。

圖4 各組細(xì)胞遷移水平

圖5 蛋白表達(dá)印跡圖

本研究采用RT-PCR 的方法檢測(cè)26對(duì)結(jié)直腸癌組織及旁癌組織中l(wèi)ncRNA H19的表達(dá)，結(jié)果顯示lncRNA H19在結(jié)直腸癌組織中明顯上調(diào)（P＜0.05），與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果一致［18］，為了進(jìn)一步研究lncRNA H19對(duì)結(jié)直腸癌化療敏感性影響，本研究構(gòu)建lncRNA H19干擾、過(guò)表達(dá)其空載對(duì)照的結(jié)腸癌細(xì)胞穩(wěn)定株。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，干擾后和過(guò)表達(dá)LoVo細(xì)胞的lncRNA H19表達(dá)水平分別為相應(yīng)對(duì)照組的0.45倍和1.54倍，提示轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)lncRNA H19后，LoVo細(xì)胞敏感性下降，而干擾lncRNA H19，敏感性增加，提示下調(diào)lncRNA H19可提高結(jié)直腸癌對(duì)5-FU的化療敏感性。用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理后腫瘤細(xì)胞遷移情況，發(fā)現(xiàn)H19表達(dá)下調(diào)能有效抑制LoVo細(xì)胞的遷移，為了進(jìn)一步探討lncRNA H19對(duì)結(jié)直腸癌耐藥調(diào)控機(jī)制，本研究檢測(cè)不同處理后腫瘤細(xì)胞在5-FU培養(yǎng)中凋亡蛋白影響，結(jié)果顯示H19過(guò)表達(dá)后LoVo細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，BCL-2蛋白表達(dá)上調(diào)，H19干擾后Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，BCL-2蛋白表達(dá)下調(diào)，提示干擾H19可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)影響細(xì)胞增殖和遷移，本研究繼續(xù)檢測(cè)細(xì)胞耐藥蛋白MDR1、MRP1和BCRP表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾H19后MDR1、MRP1和BCRP者三類耐藥蛋白明顯下調(diào)，而過(guò)表達(dá)H19 MDR1、MRP1和BCRP者三類耐藥蛋白明顯上調(diào)，提示干擾H19提升化療敏感性可能與下調(diào)耐藥蛋白相關(guān)。

綜上所述，在結(jié)直腸癌中H19表達(dá)明顯增加，干擾H19后可明顯抑制細(xì)胞增殖和遷移和促進(jìn)凋亡，提高5- FU敏感性，下調(diào)耐藥蛋白表達(dá)。但其在體內(nèi)與體外的作用是否一致，還有待進(jìn)一步研究，是潛在的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)。