EPHX1基因多態性與COPD及合并PH的發病風險的相關性研究

章 婷 徐志波

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎或肺氣腫，進一步發展為呼吸衰竭和肺心病的常見慢性疾病。吸煙是COPD發生的最重要的危險因素之一，另外還有一些其他的因素也是COPD的易感因素，如炎性細胞因子、蛋白酶、抗蛋白酶、氧化還原酶和解毒酶等。氧化應激的增加也是COPD發病的關鍵因素。身體具有完善的酶和非酶抗氧化系統來應對氧化應激，保護身體免受氧化劑的攻擊，從而抵抗氧化應激引起的氧化損傷，并且保持氧化/抗氧化的動態平衡。已知的主要氧化抑制酶包括谷胱甘肽-S-轉移酶，微粒體環氧化物水解酶（EPHX1）和血紅素加氧酶。當氧化抑制劑的產生減少或由于遺傳變異而使其活性降低時，氧化/抗氧化的動態平衡喪失，導致氧化損傷。因此，遺傳變異在COPD發病中也起著重要的作用。關于EPHX1基因多態性與COPD及合并肺動脈高壓（PH）的發病率的相關性研究較少，本研究旨在探討EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點SNPs與COPD以及并發PH的發病風險的相關性，報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2013年10月至2016年12月杭州市富陽區第二人民醫院和浙江中醫藥大學附屬第二醫院收治的120例COPD患者作為研究組，其中男71例，女49例；年齡49～76歲，平均（54.25±7.40）歲。COPD合并PH患者54例，COPD非合并PH患者66例。COPD診斷標準：參考2013年修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》［1］。PH診斷標準：超聲心動圖檢查三尖瓣反流速度＞3.4m/s，肺動脈收縮壓≥50mmHg。同期招募體檢中心的健康體檢者85例作為對照組，其中男48例，女37例；年齡48～75歲，平均（53.98±8.55）歲。納入標準：COPD和PH的診斷均符合上述相應的標準。排除標準：患有限制性通氣障礙的疾病，如阻塞性睡眠暫停低通氣綜合征、肺栓塞、肺結核、間質性肺病等患者；高血壓患者；先天性心臟病以及動脈粥樣硬化患者；自身免疫性疾病患者；有肝腎損傷性疾病的患者；有服用能夠引起PH的藥物的患者。對照組患者經病史檢查和體檢報告顯示胸片、肺功能以及心臟彩超檢查均無明顯異常。COPD合并PH患者組和COPD非合并PH組患者的年齡、性別、吸煙史、吸煙指數、FEV1、FEV1/FVC等一般資料差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）血液樣本的收集和DNA分離：所有受試者于清晨空腹時抽取肘靜脈血4ml，使用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（50）（QIAGEN，51104， 德 國 ） 提 取 基 因 組 DNA。（2）EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點SNPs分型：采用PCR-Sanger的方法，rs1051740位點引物為正向：5'-GATCGATAAGTTCCGTTTCACC -3'， 反 向：5'-ATCTTAGTCTTGAAGTGAGGAT-3'。rs2234922位點正向：5'-CCCCCAGGGCTGGACAT-3'，反向：5'-GTAGAAAGAGCCGGGCCA-3'。PCR反 應 體 系：10μmol/L上 下 游 引 物 各 1μl，4μl的 10μmol/L dNTPs，1μl 10×PCR buffer，21μl gDNA 模 板， 補足無菌水至25μl。PCR反應程序：94℃，7min預變性；30個循環的94℃變性30s，56℃退火，72℃延伸，30s；72℃孵育5min。PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后采用Sanger測序的方法分析序列信息。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料以n或%表示。采用Logistic回歸分析計算比值比（OR）、95%置信區間和雙尾P值來評估變異基因型對COPD以及合并HP的發生風險，并經年齡、性別、吸煙史、吸煙指數等校正。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征參數比較 本研究共招募120例COPD患者和85例健康對照組，兩組年齡、性別等參數之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。研究組具有吸煙史的人數以及吸煙指數顯著高于對照組，FEV1、FEV1/FVC顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點基因多態性與COPD的相關性 經Hardy-Weinberg平衡檢驗，研究組患者和健康對照組均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），見表1。研究組患者EPHX1基因rs1051740位點各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異有統計學意義（P＜0.05），rs1051740位點C等位基因攜帶者具有更高的COPD患病風險，校正后OR=1.415，95%CI=1.196～1.630，P=0.000。研究組患者與對照組EPHX1基因rs2234922位點各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異無統計學意義（P＞0.05），rs2234922位點A等位基因突變為G等位基因后COPD的發病風險并無顯著改變，校正后OR=0.992，95%CI=0.477～1.476，P=0.999。

表1 EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點基因多態性與COPD的相關性［n（%）］

2.4 EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點基因多態性與COPD合并PH的相關性 COPD合并PH組患者與COPD非合并PH組患者的EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點各基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。分析結果顯示，EPHX1基因rs1051740位點T等位基因突變為C等位基因和rs2234922位點A等位基因突變為G等位基因并不顯著增加COPD患者并發PH的風險（P＞0.05），見表2。

表2 EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點基因多態性與COPD合并PH的相關性［n（%）］

3 討論

COPD由肺氣腫、慢性支氣管炎和小氣道的結構性和炎癥性改變組成，其發病率和病死率均呈現上升趨勢［2］。COPD的發病機制比較復雜，患者的個體間差異較大，除去環境因素外，基因多態性在其中也發揮著重要的作用，目前證實已有數種基因多態性與COPD 有關［3］。

COPD的病理生理學包括多種損傷過程，包括炎癥、細胞凋亡、細胞和分子肺泡維持程序的改變、異常細胞修復、細胞外基質破壞以及氧化和抗氧化失衡。這些過程由主動或被動的吸煙所產生煙霧觸發，并由細胞衰老和感染改變。一系列受體介導的信號轉導通路被活性氧和煙草組分激活，導致多種細胞信號和細胞因子網絡受損，隨后導致慢性氣道反應，產生粘液，氣道重塑和肺泡破壞。本研究中具有吸煙史的COPD患者占67.50%，COPD患者吸煙指數顯著高于健康對照組。因此，COPD發生的風險會顯著增加。香煙煙霧中的許多毒素在肝臟中被代謝，其中幾種解毒酶微粒體環氧化物水解酶（EPHX1）已被深入研究，發現EPHX1 SNPs與其活性有關［4］。EPHX1多態性與漢族人群COPD相關性的研究顯示，即使在Logistic回歸模型中調整了性別、年齡和吸煙指數等參數，Y113H與COPD的相關性也不顯著［5］。

本研究中作者發現，COPD患者相比健康對照組rs1051740位點C等位基因頻率更高，采用Logistic回歸分析顯示，rs1051740位點C等位基因攜帶者具有更高的COPD患病風險，校正后OR=1.415，95%CI=1.196～1.630，P=0.000。分析原因可能是由于rs1051740位點T等位基因突變為C等位基因后導致EPHX1活性降低，導致芳香族氧化物濃度升高，與共價鍵結合形成大分子物質，發生免疫反應。另外，本研究結果顯示，COPD患者與對照組EPHX1基因rs2234922位點各基因型頻率和等位基因頻率之間的差異無統計學意義（P＞0.05），rs2234922位點A等位基因突變為G等位基因后COPD的發病風險并無顯著改變校正后 OR=0.992，95%CI =0.477 ～1.476，P=0.999。在一項針對高加索人群的研究顯示，rs2234922位點SNPs與COPD發病風險相關［6］，而在亞洲人群中并無這種相關性［7］，分析原因可能與人種差異有關。另外本研究結果還顯示，EPHX1基因rs1051740位點T等位基因突變為C等位基因和rs2234922位點A等位基因突變為G等位基因并不顯著增加COPD患者并發PH的風險（P＞0.05），說明EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點單核苷酸多態性與COPD并發PH的發病風險之間并無相關性，可能由于本研究樣本量大小所限，并未收集到較多的突變純合子樣本，影響了統計分析的準確性，有必要進一步擴大樣本量予以證實。

綜上所述，EPHX1基因rs1051740位點C等位基因是COPD的患病危險因素，rs2234922位點SNPs與COPD的發病風險并無顯著相關性。EPHX1基因rs1051740位點和rs2234922位點SNPs與COPD合并PH并無顯著相關性。