益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病大鼠腎組織VEGF表達的影響

張伊娜 龔麗芬 謝來娣 戴驍意 黃 平 張躍明★

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，近年來我國DN發(fā)生率在終末期腎臟疾病中呈明顯上升趨勢［1-2］。DN的發(fā)病機制目前仍不清楚，但研究已證實，腎組織VEGF異常表達參與了DN早期腎臟肥大和微量蛋白尿的產生，與DN關系密切［3-7］。目前西醫(yī)治療DN的原則主要是以控制血糖、調節(jié)脂質代謝異常為主，而隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥在治療DN中凸顯優(yōu)勢，能夠顯著減少蛋白尿產生，明顯改善腎功能。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中，糖尿病屬于消渴病范疇，消渴病日久，陰虛燥熱致耗氣傷津，因此隨著病程延長，大多出現氣陰兩虛。DN是在消渴的基礎上發(fā)展而來，屬于本虛標實之證，主要病機是以脾腎氣陰兩虛為本，以血瘀阻滯為標，病變部位在絡脈。本實驗采用鏈脲佐菌素（strepotozotocin，STZ）腹腔注射制備DN大鼠模型，予以益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠進行干預，觀察該方對大鼠腎臟形態(tài)、功能及腎組織VEGF表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5周齡SPF級健康雄性SD大鼠32只，體重（200±20）g（購自上海斯萊克有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心）。

1.2 主要試劑與儀器 益氣養(yǎng)陰活血方由黃芪、麥冬、白術、五味子、知母、山萸肉、桃仁、紅花、茯苓、玄參、旱蓮草、川芎、女貞子、葛根等組成，購自浙江中醫(yī)藥大學名中醫(yī)館，將中藥材水煎濃縮為5g/ml（按成人劑量的10倍）的水煎劑，每次準備1周的藥量，平時置于4℃中冰箱中貯存?zhèn)溆谩６蜇惿程蛊?50mg/片，購自賽諾菲（杭州）制藥有限公司］，研磨至粉狀，配成約2.5mg/ml的混懸液（按成人劑量的10倍）。STZ（購自美國Sigma公司）；兔抗VEGF多克隆抗體（bs-1313R，購自北京博奧森生物技術有限公司）；超敏酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）；羅氏血糖儀及配套試紙；7020全自動生化分析儀（日本日立公司產品）；Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司產品）；高速冷凍離心機Thermo Fresco17（美國Thermo公司產品）；PowerpacTM Universal通用電泳儀（美國Bio-Rad公司產品）；Precellys 24多功能樣品均質機（法國Bertin公司產品）等。

1.3 方法 （1）糖尿病大鼠模型建立：將雄性SD大鼠購回后，常規(guī)適應性喂養(yǎng)1周，無異常發(fā)現者，稱重，隨機分出8只設為正常組，余24只設為實驗組。實驗組禁食不禁水12h后，按60mg/kg標準統(tǒng)一在大鼠腹腔左側注射STZ溶液（溶于0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH4.2-4.5，配成1%的溶液，現用現配，避光冰浴中操作）。72h后經尾靜脈采血測各組大鼠空腹血糖（fasting blood-glucose，FBG）水平，以血糖值≥16.7mmol/L確定為造模成功［8］。對于未達標準的大鼠1周后按50mg/kg標準再次行STZ腹腔注射，同理經尾靜脈采血測血糖。本次實驗組24只大鼠全部造模成功。（2）動物分組及給藥：將造模成功的大鼠隨機分成3組，分別為模型組、益氣養(yǎng)陰活血方組（簡稱QYBP組）、厄貝沙坦組［9］，每組各8只。其中，QYBP組按照10ml/（kg·d）標準予以益氣養(yǎng)陰活血方水煎濃縮液灌胃，厄貝沙坦組按照10ml/（kg·d）標準給予厄貝沙坦混懸液，同時正常組和模型組每日予以等體積的蒸餾水灌胃。持續(xù)8周，每天固定時間段內進行灌胃操作，期間所有大鼠喂標準飲食，自由飲水，未曾使用胰島素及其他降血糖藥物。（3）標本采集與指標檢測：給藥期間，觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食、毛色、大小便等情況（記錄1次/d）；每周初測一次體重，根據體重調整給藥量；每2周用羅氏血糖儀測一次尾靜脈血糖，記錄各組大鼠FBG值。生化指標檢測：給藥8周結束后，大鼠處死前1d將大鼠放入代謝籠，收集24h尿液，取上清液，測定尿白蛋白含量，并計算尿白蛋白排泄率（UAER），為尿白蛋白含量與24h尿量的乘積。于實驗8周末在10%水合氯醛按0.3ml/100g體重標準行腹腔注射麻醉下經腹主動脈收集血標本，及時保存于-20℃冰箱中待測FBG、血肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）的含量。迅速取下大鼠腎臟，用預冷的0.9%生理鹽水反復沖洗，去被膜，用濾紙吸干腎臟表面水分。取部分左腎皮質組織，置于10%甲醛中性緩沖溶液中固定，待行HE染色。將右腎經腎門沿冠狀面剖開，取腎皮質區(qū)黃豆粒大小的腎組織塊，投入液氮中速凍，然后置于-80℃條件下凍存，待行western blot測定。腎臟組織病理學觀察：取左腎經腎門沿冠狀面剖開，將腎皮質部分投入10%甲醛中性緩沖溶液中室溫固定，石蠟包埋，制成厚度為3μm的切片，HE染色，于光學顯微鏡下行腎臟組織病理學觀察。Western blot法檢測VEGF的蛋白表達量：取-80℃凍存的各組大鼠腎皮質組織，加入裂解緩沖液，用均質機進行勻漿，12000r/min 4℃離心25min，取上清液應用BCA法，按照配制標準曲線所需溶液測定蛋白濃度，上樣電泳和轉膜。電轉后，用5%脫脂奶粉封閉液封閉2h，加入稀釋的一抗（VEGF多抗1：500），并于搖床上4℃孵育過夜，次日于室溫下用足量的PBST（含0.1%Tween-20的PBS）于搖床漂洗5min×4，加入1：10000 稀釋的熒光二抗，室溫于搖床上孵育1h，避光操作，然后用PBST洗膜5min×4（避光）。用PBS沖洗去除膜上殘留的Tween-20后，將膜放入Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上進行分析。結果采用Image S軟件分析條帶的光密度值，以gapdh作為內參照，每個條帶重復3次。

1.4 統(tǒng)計學方法 腎組織Western blot 結果采用Image S軟件進行分析，測定平均光密度。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，用單因素方差分析法（one-way ANOVA）進行組間比較及方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖值變化 8周給藥干預期間，用羅氏血糖儀給各組大鼠測FBG 1次/2周，與正常組比較，模型組的FBG水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，各治療組FBG值從給藥4周后開始明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖 1。

圖1 益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠FBG影響

2.2 各組大鼠治療后SCr、BUN和UAER變化 與正常組相比，糖尿病模型組、QYBP組和厄貝沙坦組大鼠血肌酐、尿素氮、UAER均增加（P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，QYBP組和厄貝沙坦組兩個治療組上述指標均明顯減少，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；QYBP組和厄貝沙坦組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠SCr、BUN和UAER的影響

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠SCr、BUN和UAER的影響

注：與正常組比較，*P＜0. 01；與模型組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01

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2.3 各組大鼠腎臟組織病理學變化 光鏡下HE染色可見，正常組腎小球結構清晰完整，體積正常，腎小管上皮細胞排列整齊，腎間質無異常病理變化。糖尿病模型組出現腎組織結構紊亂，腎小球肥大，系膜區(qū)彌漫性增寬，系膜細胞增生，細胞外基質增多，基底膜增厚，腎小管擴張。QYBP組和厄貝沙坦組治療后與模型組比較，以上病變均有不同程度的減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學變化（HE×400）

2.4 各組大鼠腎組織VEGF表達變化 取各組大鼠腎臟進行VEGF的Western blot檢查。采用Image S軟件分別對條帶進行分析。實驗結果顯示：模型組大鼠腎組織中VEGF表達較正常對照組明顯增加（P＜0.01）；與糖尿病模型組比較，各治療組大鼠VEGF蛋白表達量顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 益氣養(yǎng)陰活血方對DN大鼠VEGF蛋白表達的影響

3 討論

DN的發(fā)病機制及防治途徑一直是研究熱點，目前其發(fā)病機制比較公認的看法是多因素綜合作用的結果，包括糖代謝異常、腎臟血流動力學改變、氧化應激、基因異常、多種生長因子和細胞因子作用等。VEGF是一種內皮細胞特異性的絲裂原，能促進內皮細胞增殖，具有強大的促血管形成能力和促血管通透作用。機體VEGF的正常表達能夠維持腎小球濾過屏障功能與結構的完整性，促進腎臟血管的再生與修復。在腎組織中，足細胞分泌的VEGF可通過旁分泌或自分泌方式作用于內皮細胞上特異的膜受體（VEGFR），腎小管上皮細胞分泌的VEGF也可通過旁分泌方式作用從而實現生物學效應，當出現VEGF異常表達時，則會引起腎臟內皮結構與功能紊亂。有研究發(fā)現早期糖尿病大鼠模型腎臟有持續(xù)的VEGF表達，另外腎臟VEGF受體表達在早期也有增加［10］。本實驗Western blot結果顯示糖尿病模型組VEGF蛋白表達量較正常組明顯升高，與以往研究結果一致。

目前祖國傳統(tǒng)醫(yī)學認為，消渴病主要病機為氣陰兩虛，兼夾氣滯血瘀，故臨床根據虛實夾雜情況，治以益氣養(yǎng)陰，活血通絡，標本兼顧。本實驗中益氣養(yǎng)陰活血方是由黃芪、麥冬、白術、五味子、知母、山萸肉、桃仁、紅花、茯苓、玄參、旱蓮草、川芎、女貞子、葛根組成，該方充分體現了中醫(yī)整體觀念思想下，辨證施治的原則。方中黃芪和山萸肉為君藥，滋養(yǎng)肝腎、益氣健脾；麥冬、白術、五味子、茯苓、旱蓮草、女貞子、葛根為臣藥，茯苓配白術，益氣健脾，協(xié)助黃芪益氣，葛根生津止渴，麥冬生津養(yǎng)陰，五味子、女貞子、旱蓮草協(xié)助山萸肉補養(yǎng)肝腎，固腎澀精；紅花、桃仁、川芎、知母、玄參為佐使藥，其中紅花、桃仁、川芎活血行血、化瘀，使補而不留邪，祛邪而不傷正；知母、玄參寓泄于補，以泄助補，使全方寒溫并用，標本兼治。結合現代藥理研究，黃芪具有防治糖尿病腎病的作用，能夠延緩DN大鼠腎間質纖維化進程，下調TNF-α、IL-6、TGF-β1的表達［11］；研究發(fā)現，經山茱萸干預后，DN大鼠的BUN、SCr和尿酸含量、ROS、MCP-1、NF-κb表達、AKT磷酸化下調，而GSH表達上調［12］；亦有研究發(fā)現，麥冬提取物對2型糖尿病大鼠具有顯著保護作用，能明顯降低血糖，顯著提高對外源胰島素的敏感性，降低腎指數及尿蛋白排泄率［13］；茯苓多糖能有效降低血糖、血清胰島素、胰高血糖素、TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平和葡萄糖耐受力，改善糖耐量的異常；女貞子提取物具有顯著的降血糖及抗氧化活性；葛根主要成分之一葛根素可以通過下調MMP來治療早期DN，還可以有效改善DN機體的氧化應激狀態(tài)，這為葛根素作為治療DN有效藥物提供一定的依據；研究顯示，川芎嗪在保護血管、抗炎方面具有良好療效［14］。故益氣養(yǎng)陰活血方應用DN的治療具中醫(yī)理論及臨床藥理基礎。

本實驗結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠FBG水平、血肌酐、 尿素氮、UEAR均明顯增加，同時Western blot檢測結果顯示其腎組織VEGF表達明顯增多，而通過給予益氣養(yǎng)陰活血方灌胃8周后可以明顯降低VEGF的異常表達，腎臟病理改變及蛋白尿外滲等均有不同程度的改善，表明益氣養(yǎng)陰活血方對腎組織VEGF蛋白水平的影響可能是其發(fā)揮延緩和治療DN的機制之一，但這種作用的具體機制還有待深層研究。本實驗中各治療組的血糖情況與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義，表明益氣養(yǎng)陰活血方對腎功能的保護作用與改善糖代謝有關，提示可能機制之一是通過減少高血糖刺激從而減少VEGF基因轉錄，降低VEGF蛋白表達，但仍有待進一步研究。