基于p38MAPK通路研究丹參注射液對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響

陳 飛 步青云 包曉燕 金鐵峰 應帥兵 儲利勝★

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病主要并發(fā)癥之一，在1972年由Rubler等［1］第一次提出糖尿病心肌病這一概念，是指獨立于冠心病、高血壓等的特異性心肌病，其病理表現(xiàn)為心肌肥厚、彌漫性心肌壁內微血管病變，毛細血管密度降低、內皮及內皮下纖維增生和基膜增厚［2］。研究發(fā)現(xiàn)，不同的病理生理過程參與DCM發(fā)展，導致左室收縮和舒張功能不全，在這些過程中心肌纖維化是DCM的最重要特征［3］。DCM可誘發(fā)心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死［4］，危害較大，嚴重影響人類生存質量。DCM的發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明。目前越來越多的證據(jù)表明，p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路的活化與DCM的發(fā)生密切相關［5］。丹參為臨床常用的活血化瘀類中藥，具有活血祛瘀、通脈養(yǎng)心、調經(jīng)止痛、涼血消癰等功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，丹參具有多靶點的藥理作用，如降低心肌的傳導性和興奮性，提高冠狀動脈的血流量，改善心肌收縮力，抗纖維化，消炎、改善微循環(huán)等多方面的有益作用，可有效改善心肌損傷［6］。但其基于p38MAPK信號通路對心肌纖維化這一糖尿病重要并發(fā)癥的影響及作用機制尚未明確。本研究擬用鏈脲佐菌素（STZ）造成的DM模型大鼠研究丹參注射液對p38MAPK通路的干預作用，并探討丹參對DCM的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級（SPF）雄性SD大鼠40只，體重180～220g，購自上海西普爾一必凱動物有限公司。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，每籠6～7只喂養(yǎng)，動物自由覓食飲水，在室溫（20℃～25℃），濕度（50%～55%）環(huán)境下適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥物及試劑 丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司），鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma公司），兔抗鼠p38MAPK 抗體（北京博奧森公司），兔抗鼠p-p38MAPK抗體（北京博奧森公司）。

1.3 儀器 ACCU-CHEK卓越精采型血糖儀及配套試紙（德國羅氏有限公司）；7020全自動生化分析儀（日本日立公司產(chǎn)品）；Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司產(chǎn)品）；高速冷凍離心機Thermo Fresco17（美國Thermo公司產(chǎn)品）；PowerpacTM Universal通用電泳儀（美國Bio-Rad公司產(chǎn)品）；Precellys 24多功能樣品均質機（法國Bertin公司產(chǎn)品）等。

1.4 方法 （1）動物模型復制：將40只SD雄性大鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機抽取6只大鼠作為正常對照組，其余大鼠作為實驗組，明暗周期12h /12h，自由攝食，飲水。正常組喂以基礎飼料至實驗結束，實驗組喂以高脂高糖飼料（飼料組成：10.0%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，66.5%常規(guī)飼料）1個月，誘發(fā)胰島素抵抗，禁食12h后按30mg/kg腹腔注射STZ溶液（溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH4.0～4.5），配成1%的溶液）。5天后檢測血糖指標不達標者再按25mg/kg 腹腔注射STZ。造模成功的標準：于最后1次注射5d后測定尾靜脈隨機血糖＞16.7mmol/L者為T2DM造模成功。（2）分組與給藥：將造模成功的24只大鼠隨機分為模型組、丹參低、中、高劑量組，每組6只。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，實驗組繼續(xù)給予高脂高糖飼料。丹參低、中、高劑量組分別腹腔注射丹參注射液0.75、1.5、2ml/kg/d，正常對照組和模型對照組注射等體積的生理鹽水，注射時間為每日中午12點至13點，連續(xù)8周。（3）FBG、TG、TC、LDL、HDL的測定：采用7020全自動生化分析儀測定。（4）Masson染色：取大鼠左室心尖部約1mm×1mm×2mm心肌組織，4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片后，以Masson染色法染色，顯微鏡下觀察攝像。（5）Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達：取各組小鼠左心室心肌組織，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）比色法進行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠用于電泳分離蛋白，上樣前蛋白樣品95℃煮5 min，每孔組織蛋白上樣量相等，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白。將目的條帶切下，60V濕轉膜2h，將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯膜。用三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）配制的5%脫脂奶粉封閉2 h，封閉后用p38MAPK、p-p38MAPK一抗（稀釋比例為1：100）37℃孵育1 h后4℃過夜。TBST洗膜3次，5rain/次，用HRP標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1：2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，5 min/次。增強化學發(fā)光法（ECL）顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件進行光密度分析，以β-actin為內參。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丹參注射液對大鼠血糖及血脂的影響 見表1。

表1 丹參注射液對DM大鼠血糖及血脂的影響［mmol/L，］

表1 丹參注射液對DM大鼠血糖及血脂的影響［mmol/L，］

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

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2.2 丹參注射液對DCM大鼠心肌組織形態(tài)的影響 根據(jù) Masson染色觀察到，正常對照組大鼠細胞核為深藍色，膠原纖維染成藍綠色，少量均勻分布，心肌細胞染成紅色；模型組心肌細胞間質膠原纖維表達增加，排列紊亂，分布不均勻；丹參低、中、高劑量組心肌膠原纖維分布較模型組均勻，且膠原表達量減少，其中高劑量組最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學變化(Masson ×400)

2.3 丹參注射液對DCM大鼠p38 MAPK及p-p38MAPK蛋白表達的影響 見表2、圖2。

表2 丹參注射液對DM大鼠心肌MAPK通路的影響

表2 丹參注射液對DM大鼠心肌MAPK通路的影響

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

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圖2 Western blot 法檢測p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達（A：正常對照組；B：模型組；C：丹參低劑量組；D：丹參中劑量組；E：丹參高劑量組）

3 討論

近年來，DM的發(fā)病率逐年增高，且其心血管并發(fā)癥已經(jīng)成為糖尿病患者死亡的主要原因。DCM是DM患者的主要并發(fā)癥之一，發(fā)病率高、危害性大，與DM患者心血管疾病高發(fā)生率和高病死率密切相關。其中心肌纖維化是在許多不同的心臟疾病條件下發(fā)生的一種常見的病理過程，可以加重心肌僵硬，妨礙心室收縮和舒張功能，最終引發(fā)心力衰竭，甚至猝死。

近年來中藥以整體治療為指導思想防治DCM，具有多靶點、多階段性，不良反應少等優(yōu)點。中醫(yī)認為，糖尿病心肌病屬于中醫(yī)消渴心病的范疇，結合古代醫(yī)家對“毒”及“絡病”的認識，DCM基本病機為本虛標實，虛滯、瘀阻、毒損心絡為糖尿病心肌病的病機關鍵。各種炎癥因子即為毒，心絡瘀阻是DCM 發(fā)病的基本病理基礎。因此，根據(jù)中醫(yī)辨證論治之法，臨床上多以益氣養(yǎng)陰及活血化瘀法治療并取得了較好的療效。丹參，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為唇形科鼠尾草屬植物的干燥根和根莖，味苦、性微寒，入心肝二經(jīng)。丹參為常用的活血化瘀類中藥，臨床上多被用于治療冠心病，不穩(wěn)定的心絞痛，腦血管疾病和糖尿病血管并發(fā)癥。近年來，西醫(yī)基礎治療結合丹參治療糖尿病心肌病具有滿意的效果。

DCM的發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明。目前越來越多的證據(jù)表明，p38 MAPK信號通路的活化是糖尿病血管和視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)痛、腎病等并發(fā)癥的共同通路，而p-p38 MAPK是該通路激活的關鍵［7］。p-p38 MAPK可直接促進其下游轉錄因子NF-κB 的活化和核轉位，后者可啟動或增強 TNF-α、IL-6 等炎癥相關基因的轉錄和表達，進而加劇 DCM 炎癥損傷。本實驗結果表明，模型組大鼠心肌存在 p38 MAPK 信號通路的活化，丹參中、高劑量組能夠明顯抑制 p-p38 MAPK 的活化，從而發(fā)揮抗炎和心臟保護作用。陳明等［8］用無患子苷對自發(fā)性高血壓大鼠的炎癥反應進行干預研究，發(fā)現(xiàn)其可通過p38 MAPK通路介導抗炎作用，從而對心肌纖維化起到一定的逆轉作用。Westermann等［9］用 p38MAPK 阻斷劑 SB203580阻斷STZ誘導的糖尿病心肌病實驗鼠時，發(fā)現(xiàn)其心臟功能增強與腫瘤壞死因子TNF-α、白介素（IL-1β、IL-6）和轉化生長因子TGF-β的減少有關。而Wang等［10］用p38MAPK 阻斷劑BIRB0796阻斷用IL-1處理的心肌成纖維細胞時，發(fā)現(xiàn)其炎癥因子釋放減少。與本研究結果一致，提示 p38 MAPK 作為細胞信號傳遞的共同通路，可能是DCM治療的潛在靶點。

綜上所述，丹參注射液對 DCM 具有保護作用，其機制可能下調 p38 MAPK表達，降低磷酸化的p38MAPK發(fā)揮生物學效應，進而抑制炎癥反應有關，以p38 MAPK 信號通路為切入點有可能減輕或改善DCM。