萬古霉素提取工藝優(yōu)化及高純度萬古霉素的制備

李志強(qiáng) 朱明新 王玲燕

摘 要：我國萬古霉素分離純化提取工藝于上世紀(jì)90年代末開發(fā)成功，受到價(jià)格優(yōu)勢及管理水平因素影響，全球市場萬古霉素原料藥95%已被中國占領(lǐng)，但在國際化競爭日趨激烈背景下，萬古霉素提取工藝水平有所提升，高品質(zhì)制藥成為市場準(zhǔn)入衡量依據(jù)。對此，本文分析萬古霉素工藝優(yōu)化方式，提出幾點(diǎn)高純度萬古霉素的制備建議。

關(guān)鍵詞：萬古霉素提取工藝優(yōu)化；高純度萬古霉素的制備

在新時(shí)期，我國萬古霉素提取與制備受到廣泛重視，主要是我國萬古霉素市場價(jià)格的優(yōu)勢，管理水平很高，占據(jù)了國際市場。但目前國際市場對萬古霉素的制備要求有所提升，為更好的進(jìn)行萬古霉素的高純度制備，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注提取工藝的優(yōu)化改革，形成獨(dú)特優(yōu)勢。

1 萬古霉素理化性質(zhì)分析

萬古霉素通常穩(wěn)定性很低，難以精制或結(jié)晶，因此制備難度相對較高。在臨床使用中，主要為萬古霉素鹽酸鹽，其分子式C66H75Cl2N9O24·HCl，分子量是1486。萬古霉素外觀顏色為白色，呈現(xiàn)固體狀態(tài)，水溶性100mg/mL之上，可在甲醇中溶解，但不在高級醇類或乙醚中溶解。如若為低濃度尿素，可在其中添加水提升溶解度。萬古霉素分子主要是兩個(gè)基本結(jié)構(gòu)組合而成，其中糖基結(jié)構(gòu)主要為氨基糖與葡萄糖等。如圖1所示萬古霉素分子結(jié)構(gòu)形式。

2 萬古霉素提取原理分析

萬古霉素被發(fā)覺之后，早期未得到廣泛重視與使用，主要用來進(jìn)行金黃色葡糖球菌感染處理，然而，耐青霉素細(xì)菌產(chǎn)生量增加之后，萬古霉素受到廣泛關(guān)注，在大量生產(chǎn)之后，作用開始逐漸提升。由于初期提取過程中，提取工藝較為滯后，并且萬古霉素的穩(wěn)定性很差，無法開展精制處理或是結(jié)晶處理，所以，萬古霉素的提取純度很低。在實(shí)際如圖2所示，在了解降解途徑后，全面分析提取原理：①具有較高的細(xì)胞壁形成的抑制作用，可達(dá)到殺菌效果；②對新細(xì)胞功能造成一定影響，形成細(xì)胞膜的破壞性效果；③對蛋白質(zhì)形成進(jìn)行干擾，形成微生物的生長抑制作用；④能夠抑制核酸的合成，并且降低微生物生長速度，或是從根本上形成抑制的效果。而萬古霉素的作用原理為：對細(xì)胞壁的合成進(jìn)行抑制，提升殺菌效果。

3 萬古霉素提取工藝優(yōu)化分析

①發(fā)酵液預(yù)處理工藝：發(fā)酵液預(yù)處理屬提取工藝最初操作環(huán)節(jié)，實(shí)際處理中，需結(jié)合圖3的情況進(jìn)行分析，主要開展發(fā)酵液處理工作，以此加快過濾速度，去除雜蛋白成分與固體顆粒成分，為高純度的制備工作夯實(shí)基礎(chǔ)，提升生產(chǎn)效果與品質(zhì)。對于發(fā)酵液預(yù)處理，在其中添加絮凝劑，調(diào)節(jié)溫度，去除固體物質(zhì)，提升過濾效果。對pH值的調(diào)節(jié)，可靠性較高，發(fā)酵液穩(wěn)定性顯著，應(yīng)做好優(yōu)化處理工作；②發(fā)酵液陶瓷膜微濾工藝：發(fā)酵液中菌絲濃度通常較高，殘留一定比例的培養(yǎng)基，所以，在樹脂吸附環(huán)節(jié)前期，需過濾處理。而陶瓷膜過濾工藝在使用過程中，孔徑較佳，有利提高過濾通過量與效果。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，過濾通過量與孔徑之間并非正向比例，而是曲線關(guān)系，主要因?yàn)榫w夾雜在過濾物質(zhì)中，不斷積累，形成凝膠層，積累量增加后，導(dǎo)致過濾阻力不斷提升，如圖4所示，對過濾效果產(chǎn)生影響。所以此類工藝優(yōu)化的過程中，需要開展膜孔徑計(jì)算工作，結(jié)合實(shí)際情況對通過量進(jìn)行控制，以此提升過濾質(zhì)量；③解吸液脫色工藝：萬古霉素實(shí)際發(fā)酵期間，夾雜很多碳元素、氮元素、微量元素等物質(zhì)，在培養(yǎng)期間形成副產(chǎn)物，如：富含蛋白質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵液的顏色編程褐色。為了制備出白色粉末的萬古霉素，消除其中褐色色素，使用解吸脫色工藝開展工作。當(dāng)前，最常用的是活性炭工藝與大孔吸附樹脂工藝。使用此類工藝時(shí)，容易受活性炭加量因素、起始pH值因素及脫色時(shí)間因素影響，因此需利用實(shí)驗(yàn)分析，如表1所示，實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)脫色效果與脫色收率之間呈正交關(guān)系，所以要對各類因素嚴(yán)格分析與詳細(xì)調(diào)查，使用此工藝前開展多方面調(diào)整工作。

在萬古霉素解吸液脫色期間，對脫色效率產(chǎn)生影響的因素較多，最為主要的就是活性炭添加數(shù)量因素、初始的pH值因素以及攪拌時(shí)間等，同時(shí)還有溫度以及濕度因素，但溫度與濕度對其影響的程度較小，可忽略不計(jì)。反復(fù)試驗(yàn)之后發(fā)現(xiàn)，在活性炭添加數(shù)量為2.1%且初始pH值為3.1，攪拌時(shí)間為61分鐘時(shí)，脫色效果最好，可達(dá)到95.6%左右，有利于提升脫色效率與質(zhì)量，并促進(jìn)產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效益與經(jīng)濟(jì)全面提升，所以，使用此類工藝的過程中，需要對活性炭的添加數(shù)量以及其他因素進(jìn)行嚴(yán)格控制，以此提升脫色效果。

4 高純度萬古霉素制備

傳統(tǒng)制備工作受滯后性工藝影響，只能采用溶劑結(jié)晶方式處理，純度較低，例如：甲醇溶劑結(jié)晶、乙醇溶劑結(jié)晶、異丙醇溶劑結(jié)晶、丙酮溶劑結(jié)晶或氯化銨與氯化鈉溶劑結(jié)晶，使萬古霉素沉淀，得到成品。但此類制備方式制取純度較低，成品含很多雜質(zhì)，導(dǎo)致萬古霉素純度不能滿足歐洲藥物基本純度標(biāo)準(zhǔn)。如圖5：萬古霉素濃縮液分析。現(xiàn)代化藥物制備技術(shù)發(fā)展過程中，色譜分離技術(shù)等得到較好進(jìn)步，可利用色譜分析方式，制備出純度超95%的成品，再使用乙醇溶劑結(jié)晶方式，得到高純度成品。但此類制備技術(shù)尚未將純度控制在98.1%以上，且色素處理未能體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢，所以要進(jìn)一步制備分析與研究。

通過實(shí)驗(yàn)方式制備高純度萬古霉素，準(zhǔn)備萬古霉素粗品與標(biāo)準(zhǔn)品材料，利用改為高純度萬古霉素的制備、鹽酸等純試劑分析，采用高效液相色譜檢測試劑分析。準(zhǔn)備高效液相色譜儀、電子天平、色譜柱、實(shí)驗(yàn)室膜分離儀器、玻璃析柱、凍干燥劑及pH測量儀等。制備萬古霉素濃縮液，將250克粗品放置燒杯中，與2升純化水相溶解，均勻攪拌后，等待完全溶解，使用孔徑0.2um左右濾膜過濾處理，得到最終上柱液。使用改為高純度萬古霉素的制備將其制作為直徑60厘米、高度8厘米玻璃層柱，實(shí)際研究中，還需將上柱量設(shè)為整體體積4%左右，使用吸附方式將上柱液與20%層析料有機(jī)整合，直接上柱，再使用純化水清洗，洗滌后采用甲醇預(yù)清洗處理。再使用5%甲醇溶液與鹽酸溶液開展萬古霉素洗脫工作，分段收集處理。此外還需對萬古霉素液體濃縮，純度為96%。色譜分析過程，主要是色譜儀器分析處理，按具體要求與標(biāo)準(zhǔn)完成分析任務(wù)，對脫氣處理與洗脫處理程序研究，了解其中是否存在缺陷與不足，然后利用制備工藝技術(shù)開展相關(guān)工作，使各方面制備純度與效果符合要求，通過正確方式操作提升制備純度。

我國醫(yī)療行業(yè)實(shí)際發(fā)展過程中，藥物管制越來越嚴(yán)格，尤其在現(xiàn)代化技術(shù)發(fā)展背景下，藥物種類增加，質(zhì)量提升，市場準(zhǔn)入要求更嚴(yán)格。醫(yī)院與相關(guān)醫(yī)藥客戶對萬古霉素純度提出很高的標(biāo)準(zhǔn)，因此，在實(shí)際生產(chǎn)的過程中，除了優(yōu)化工藝方式，還需探索最佳的高純度制備方法，遵循低成本高質(zhì)量的生產(chǎn)原則。