姜黃素對人結腸癌腫瘤樣干細胞中VEGF表達的作用

謝光洪 趙逵

(1.貴州省人民醫院急診內科,貴州 貴陽 550001;2.遵義醫學院附屬醫院消化內科,貴州 遵義 563099)

結腸癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一[1],其死亡率居惡性腫瘤死亡率第三位。近年來由于人們生活水平較前明顯改善,生活方式及飲食結構較前有很大變化,如低纖維、高脂肪及高蛋白飲食等,導致結腸癌發病率呈不斷上升趨勢,且發病年齡不斷趨于年輕化。研究認為結腸癌的發生、發展是一個多因素、多基因、多步驟共同參與的過程[2]。臨床上一旦診斷結腸癌常常采取手術及放化療、靶向治療等綜合治療措施。VEGF是一種血管內皮生長因子,它能夠促進腫瘤血管的生成從而促進腫瘤的生長,分化良好的血管又能夠產生VEGF[3]。不斷增多的VEGF參與結腸癌的發生、發展及轉移[4-6]。姜黃素是一種植物多酚,具有抗炎癥,抗腫瘤等作用,但機制仍然不清楚。本研究采用姜黃素作用于體外培養人結腸癌細胞株HT-29和SW480對數生長期細胞,檢測細胞中VEGF基因及蛋白含量表達的變化,為臨床用藥提供一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料 人結腸癌細胞株HT-29及SW480;含10%胎牛血清的改良型1640培養基(海克隆公司生產),37℃二氧化碳孵箱,細胞培養箱。

1.2藥物、主要試劑及方法 姜黃素(Curcumin)(Sigma公司產品);胎牛血清(hylone公司產品);RIPA組織細胞裂解液(北京博奧森生物技術有限公司產品)。

1.3檢測方法 利用熒光顯微鏡觀察姜黃素處理48 h后的每個視野下細胞生長及增殖情況。利用實時定量PCR 檢測藥物處理后HT-29、SW480細胞中VEGF的mRNA表達變化:每種細胞傳4瓶,陰性對照各1瓶,其中HT-29給藥濃度為21 μmol/L,SW480給藥濃度為48 μ mol/L,分別培養12、24、48 h,提取VEGFmRNA,用實時定量PCR檢測mRNA水平的變化。利用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測姜黃素處理腫瘤細胞后VEGF蛋白質水平的表達變化:用蛋白免疫印跡檢測姜黃素干預12、24、48 h后HT-29、SW480細胞中VEGF蛋白表達的變化。

2 結 果

2.1姜黃素干預48 h后顯微鏡下HT-29及SW480 細胞形態及數目改變 與對照組相比,姜黃素組隨著作用時間延長,細胞數量在減少,同時胞體回縮,細胞變得粗糙。見圖1。

對照組 HT29 SW480

2.2PCR(Real-time PCR)檢測藥物處理后HT-29、SW480細胞中VEGF的mRNA表達變化 姜黃素干預后的HT-29細胞株和SW480細胞株,與空白對照相比,VEGF的mRNA表達明顯降低,且呈時間依賴關系,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1,圖2、3。

表1 姜黃素干預后HT-29、SW480細胞中VEGF的mRNA表達變化

圖2 HT-29細胞中VEGF的溶解曲線

圖3 SW480細胞中VEGF的溶解曲線

2.3蛋白免疫印跡(Western blot)檢測藥物處理腫瘤細胞后VEGF蛋白質水平的表達變化 姜黃素干預后的HT-29細胞株和SW480細胞株,與空白對照相比,VEGF蛋白質水平表達明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2,圖4。

表2 姜黃素干預后HT-29、SW480細胞中蛋白質水平的表達變

圖4 Western blot檢測姜黃素干預后HT-29及SW480中VEGF的表達

3 討 論

結腸癌的發病機制非常復雜,目前研究認為是多基因、多因素、多階段相互作用的結果。其中豐富的血運促進了腫瘤細胞的迅速生長與增殖[7]。VEGF參與了腫瘤血管的生成及生長,為腫瘤細胞提供了充足的營養,同時為腫瘤細胞的轉移創造了條件[8-11]。

姜黃素是從姜科植物中提煉出來的一種植物多酚,廣泛應用于各種食物中。隨著研究發現姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用。它還有一個特點是幾乎無副作用,不會給患者的健康帶來負面作用。姜黃素可抑制花生四烯酸(AA)代謝途徑的環加氧酶(COX)和脂加氧酶(LOX)活性[12]以及與腫瘤促發密切相關的蛋白激酶(PKC)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)等活性。此外,研究發現姜黃素抑制結腸癌細胞增殖主要是通過阻滯細胞周期的G2/M期[13]誘導細胞停滯。姜黃素對結腸腫瘤細胞的生長、增殖、轉移均有抑制作用[14-17]。

本實驗采用姜黃素干預體外培養的結腸癌細胞株HT-29、SW480,通過相差顯微鏡觀察姜黃素處理后每個高倍鏡視野下細胞數目的生長與增殖受到抑制,與時間呈正相關性,通過PCR和Western blot檢測VEGF基因和蛋白的表達,觀察到姜黃素干預后的細胞中VEGF表達較對照組降低,且隨著時間的延長其抑制作用增強。本研究通過VEGF作為作用靶點,為進一步姜黃素抑制結腸癌細胞生長和增殖及轉移的分子機制奠定基礎。 但黃素如何抑制結腸癌腫瘤細胞細胞機制尚不明確,有待進一步的研究。