HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方苦參腸炎康片中4種有效成分含量

閆 研，秦 斌，王鐵杰，殷 果

（深圳市藥品檢驗(yàn)研究院 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057）

復(fù)方苦參腸炎康片是由苦參、黃連、黃芩、白芍、車前子、金銀花、甘草、顛茄流浸膏制成的中藥復(fù)方制劑。具有清熱、燥濕、止瀉的功能，可用于濕熱泄瀉、癥見泄瀉急迫或?yàn)a而不爽、肛門灼熱、腹痛、小便短赤和急性腸胃炎等疾病的治療，在2015版中國(guó)藥典中以苦參堿和氧化苦參堿為含量測(cè)定成分[1]。對(duì)于方中同樣發(fā)揮重要療效的有效成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷和甘草酸的含量并未作出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，因此難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量。目前，對(duì)于芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸中單一或3種成分的高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法已有報(bào)道[2-6]，但同時(shí)測(cè)定4種成分的HPLC含量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。本文建立了同時(shí)測(cè)定復(fù)方苦參腸炎康片中芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸含量的HPLC方法。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，專屬性好，對(duì)于復(fù)方苦參腸炎康片的質(zhì)量控制有重要的補(bǔ)充意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀,包括LC-20AD高壓泵、LC solution 色譜工作站、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、SPDM20A紫外檢測(cè)器、CTO-10Asvp柱溫箱、CBM-20A控制箱（日本島津公司)；XS204分析天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品( 批號(hào)：110715-201318，純度：93.3 %)，鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：86.7 %） ，芍藥苷對(duì)照品 ( 批號(hào)：110736-201539，純度：96.4 %)，甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)：110731-201418，純度：93.1 %）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；復(fù)方苦參腸炎康片 (通化東寶藥業(yè)，批號(hào)：150602，規(guī)格：0.4 g/片)；乙腈為色譜純（德國(guó)Merk公司），甲醇、乙醇、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取減壓干燥至恒重的芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿、甘草酸對(duì)照品各適量，加甲醇分別制成芍藥苷1.8 mg/ml、黃芩苷3.0 mg/ml、鹽酸小檗堿2.4 mg/ml和甘草酸0.3 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.0 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，混合均勻，即得含芍藥苷0.36 mg/ml、黃芩苷 0.6 mg/ml、鹽酸小檗堿 0.48 mg/ml、甘草酸0.06 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取樣品適量，置研缽中研細(xì)，取粉末約1.0 g，精密稱定，置入50 ml量瓶，加75 %乙醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置 10 min，取上清，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例和制備工藝，取缺少黃芩提取物、黃連提取物、芍藥提取物和甘草提取物的其他中藥材，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2 %磷酸，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，混合對(duì)照品溶液色譜圖中芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸的分離度＞1.5，理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)算不低于6000；陰性對(duì)照溶液對(duì)4 個(gè)測(cè)定組分無(wú)干擾，見圖1。

圖1 對(duì)照品混合溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的HPLC圖譜

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別置入10 mL量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。結(jié)果表明，芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程與線性范圍

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣 6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸峰面積的RSD分別為為1.22 %，1.12 %，1.25 %和1.68 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液適量，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸峰面積的RSD分別為0.68 %，0.63 %，1.35 %和0.54 %（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品適量，精明稱定，按2.1.2項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量。結(jié)果，芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸含量的RSD分別為1.66 %，1.75 %，1.84 %和1.70 %（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，平行分組，每組3份，每組記一個(gè)平均值，分別按相當(dāng)于樣品中各組分含量的80 %，100 %，120 % 加入2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和甘草酸的平均回收率（n=6）分別為102.8 %，99.9 %，101.8 %和97.7 %，RSD分別為0.48 %，1.99 %，1.59 %和0.80 %。

2.4 樣品測(cè)定

按2.1.2項(xiàng)方法制備3份供試品溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí)，對(duì)提取溶劑[含1 %鹽酸的甲醇-水（50:50）、甲醇、75 %乙醇）]進(jìn)行了考察，綜合考慮試驗(yàn)效果等因素，最終確定本試驗(yàn)提取溶劑為75 %乙醇。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了4個(gè)成分，但最大吸收波長(zhǎng)各不相同，黃芩苷和鹽酸小檗堿在245，275 nm處均有較大吸收，芍藥苷、甘草酸分別在240，245 nm處有最大吸收。分別提取這3個(gè)波長(zhǎng)處的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種成分均在245 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，且雜質(zhì)峰干擾較少，因此選擇245 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

研究中分別以乙腈（A）-0.5 %三乙胺水溶液（B）（用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0）和乙腈（A）-0.2 %磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫。以乙腈（A）-0.5 %三乙胺水溶液（B）（用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0）為流動(dòng)相時(shí)，基線漂移較大，分離效果不理想。選擇乙腈（A）-0.2 %磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，各組分分離效果好，基線穩(wěn)定。

3.4 色譜柱的選擇

預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別采用了Capcell PAK C18MGⅡ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)Capcell PAK C18MGⅡ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離效果不太理想，Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離效果好，故選用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。