HPLC測定黃精的指紋圖譜

李松濤，于 曉，耿翠翠，劉志萍，車 勇，孔 青

（山東醫藥技師學院，山東 泰安 271000）

黃精為百合科黃精屬植物，是中國常見的中藥材之一[1]，主要用于治療心血管疾病、糖尿病和提高免疫力、抗腫瘤等方面。黃精分布于華東、華北、西北、中南等區域，其藥材質量隨生長地理環境的不同差別很大[2]，加之黃精屬植物外觀上形狀相似，難以區分，嚴重阻礙高質量黃精產業的發展及應用[3]。已有研究通過測定單一成分葡萄糖含量評價黃精的質量，但該指標成分評價方法無法精確、全面地反映藥材質量，其他對黃精藥材質量標準方面的研究鮮有報道。

中藥色譜指紋圖譜方法是一種完整性、綜合性質量控制方法，具有均一性和穩定性[4]，在中藥如雪飛、丹參質量控制方面廣泛應用。本研究擬通過收集泰安不同地理位置的黃精，利用HPLC建立山東泰安的黃精指紋圖譜，并與其他區域黃精指紋圖譜進行對比，以期為泰安黃精藥材質量評價提供參考。

1 儀器與試材

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫G4212B 二極管列陣檢測器，安捷倫 Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），KH500B型超聲清洗器（昆山GRAD），明澈D24UV超純水系統（密理博中國），HH-W420水浴鍋（江蘇榮華），DHG-9076A電熱干燥箱（上海精宏），加熱回流設備；無水乙醇（COMIO），色譜級乙腈（Fisher Scientific）。

1.2 供試材料

山東黃精采于山東泰安，共10個批次。對照黃精采于河北，共2個批次（見表1）。標準品薯蕷皂苷元（111539）、薯蕷皂苷（111707）、人參皂苷Rb1（110704），均購自中國食品藥品檢驗研究院。

表1 12批次黃精產地及采集信息

2 黃精指紋圖譜的建立與結果分析

2.1 色譜條件

安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫G4212B二極管列陣檢測器，安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 ml/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，進樣量40 μl，以乙腈（下文用體積分數）和水為流動相，采用二元梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備

精確稱取薯蕷皂苷元、薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1標準品適量，用80 %乙醇溶解后通過0.45 μm濾膜過濾即得對照品溶液,對照品溶液濃度分別為薯蕷皂苷元（0.306 mg/ml）、薯蕷皂苷（0.304 mg/ml）、參皂苷Rb1（0.304 mg/ml）。

2.3 指紋圖譜供試品溶液的制備

黃精清洗后置于55 ℃烘箱烘干至恒重（約30 h），經粉碎機粉碎后過篩（40目），將精密稱取的1 g黃精粉末加乙醇（φ=80 %）20 ml搖勻，于86℃水浴裝置中回流提取3 h，熱過濾取濾液，經0.45 μm濾膜濾過即得樣品。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取HJ-1批次黃精1 g，依照“2.3”方法制備樣品溶液，用HPLC按照“2.1”色譜條件連續測定5次記錄指紋圖譜，以14號峰為內參照峰，得各共有峰相對峰面積RSD為0.134 %～1.633 %，相對保留時間RSD為0.022 %～0.182 %，結果表明，儀器具有良好的精密度[5]。

2.4.2 重復性試驗 取5 份同一藥材的粉末樣品，依照“2.3”方法制備樣品溶液，用HPLC按照“2.1”色譜條件測定, 以14號峰為內參照峰，計算16個分離度好的主組分峰的相對峰面積RSD為0.266 %～1.742 %，相對保留時間RSD為0.037 %～0.435 %之間，結果表明，該提取方法具有良好的重復性[5]。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批次黃精藥材粉末，按照“2.1”色譜條件，分別于 0，3，6，9，12，24 h 依次進行進樣測定，以峰14為內參比，計算出16個分離度好的主要組分的相對峰面積RSD為0.136 %～1.633 %，相對保留時間RSD為0.026 %～0.286 %，結果表明，樣品在24 h內穩定性好[5]。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

對采集的10批山東泰安的黃精樣品分別按“2.3”方法處理制成供試品溶液，注入高效液相色譜儀按“2.1”色譜條件測定。通過分析比較10批次樣品的HPLC色譜圖，將吸收強、穩定性好的16個峰標定為共有特征峰，各共有峰相對保留時間的RSD為0.21 %～1.86 %，表明以此為基準建立的黃精藥材主要成分對照指紋圖結果可靠。通過共有模式生成法即將10批黃精樣品的指紋圖譜測定結果導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件中進行數據處理，設置參照圖譜后多點校正生成對照圖譜[6]（見圖1），各共有峰相對保留時間為0.2239，0.2544，0.276，0.3538，0.3765，0.4194，0.4848，0.51，0.5298，0.7616，0.8059，0.9363，0.9823，1，1.0762，1.1523。各批次間的相似性均在0.9以上,表明這10批次黃精藥材間相似性良好。通過查閱文獻，以薯蕷皂苷元、薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1為標準品分別注入液相色譜儀進行比對[7-8]，結果表明，6號峰為薯蕷皂苷元，13號峰為人參皂苷Rb1。

圖1 山東泰安黃精參照峰圖譜

2.6 不同批次黃精指紋圖譜的比較

山東泰安黃精確定的16個共有峰在這10個不同批次的黃精藥材中均能檢測到（見圖2），表明10批藥材主要活性成分相似。各產地黃精樣品中5，7，8，9，14峰的峰面積較大，表明5個指紋峰對應的成分在泰安黃精中占比較大為主要成分。不同批次間相同成分含量有明顯差異，5，7，8，9號峰在各批次的差異明顯。將10批黃精藥材指紋圖譜分析結果導入中藥指紋圖譜相似度評價體系中以16個共有指紋峰的峰面積為基本參數，對10個批次黃精的相似性進行評價，各批次黃精間相似性均在0.9以上，批次1，2，5，6四個批次的相似性在0.99以上，批次3，4，7，8，9，10六個批次的相似性在0.99以上。批次1，2和批次5，6的成分明顯低于其他6個批次，初步推斷海拔高度造成的地理位置差異影響藥材成分含量差異，有待進一步研究。

圖2 不同批次的泰安黃精指紋圖譜比較

2.7 不同產地黃精指紋圖譜的比較

由圖3可見，山東泰安黃精中共鑒定出16個共有峰，河北黃精中共鑒定出12個共有峰。山東泰安黃精中的1，2，3，6，10號峰在河北黃精中未檢測到，河北黃精的3號峰在山東泰安黃精中沒有檢測到，其余11個峰在泰安黃精和河北黃精中均能檢測到，為共有峰。綜合對比，泰安黃精和河北黃精的指紋圖譜差異明顯，可用指紋圖譜對泰安黃精和河北黃精進行區分。

圖3 山東黃精和河北黃精指紋圖譜對比

3 結論與討論

3.1 黃精成分的定量評價

黃精藥材在陜西、河北等地分布較為廣泛，通過綜合對比山東泰安黃精和河北主產區黃精指紋圖譜，表明可通過指紋圖譜區分兩個產地的黃精。標準品匹配確定6號峰為薯蕷皂苷元，13號峰為人參皂苷Rb1，由于此兩種成分在各批次中含量較少，未做指標成分評價。本研究發現5，9，14號峰在12個批次黃精指紋圖譜中峰面積均較大，但仍不清楚其成分，可進一步研究其結構和物質確定以完善黃精質量評價。本研究僅通過對比指紋圖譜評價黃精質量存在一定局限性，還需結合多糖多指標成分等進行定量分析以做出綜合評價[9-10]。

3.2 黃精質量的影響因素

通過泰安黃精10個批次指紋圖譜的對比分析，采集于海拔較高的山區的4個黃精批次和其余6個采集于平地的黃精成分含量存在明顯差異，表明海拔是影響黃精成分的因素之一。由于本研究采集樣品數量有限，其他生長地理環境對黃精成分的影響有待進一步展開研究。

3.3 提取方法及色譜條件的改進

分別對比了超聲提取和加熱回流提取兩種提取方式，超聲提取的樣品峰較少，本試驗選定加熱回流方法作為黃精藥材指紋圖譜供試品溶液的提取方法。取多份同一產地黃精藥材各1 g，以相同色譜條件下的色譜峰數目作為考察指標，提取溶液（乙醇φ=50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，無水乙醇），提取溶液與樣品量比（10倍，15倍，20倍，25倍），加熱回流時間（30，60，90，120，150，180，210 min），結果表明，黃精藥材用φ=80 %乙醇，20倍其質量條件下加熱回流提取3 h，提取效果較好。用安捷倫1260二元高效液相色譜儀，安捷倫 G4212B 二極管列陣檢測器經多波長（190～400 nm）考察后確定203 nm為本實驗方法的檢測波長。同時還考察了不同柱溫對分離的影響，結果表明，30 ℃時分離最好。同時用甲醇-水和乙腈-水兩種體系等梯度和不同梯度進行洗脫，結果表明，乙腈-水溶液作為流動相，峰形較好，分離度好。在樣品處理過程中，熱過濾效果明顯高于冷卻后過濾的效果，初步推測是黃精成分中多糖物質的干擾，有待進一步探討。