揚(yáng)州市結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變分析

王金富 曾方林 戴潔

（揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院 江蘇 揚(yáng)州 225000）

異煙肼（INH）對(duì)結(jié)核分枝桿菌（MTB）具有較強(qiáng)的殺菌作用，是治療結(jié)核病重要的一線藥物。近些年，INH的耐藥率逐漸上升，全國(guó)抽樣調(diào)查顯示我國(guó)INH耐藥率已達(dá)17.6%，屬高耐藥國(guó)家。

INH的耐藥主要是由于基因突變?cè)斐桑饕铝谢蚋淖冇嘘P(guān)：過氧化氫一過氧化物酶基因katG、烯酸基載體蛋自還原酶基因inhA、NADH脫氫酶基因ndh、酮酸基酸基轉(zhuǎn)移蛋自酶基因kasA、烷基過氧化氫酶基因ah-pC等[1]。本研究利用基因芯片技術(shù)對(duì)揚(yáng)州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變位點(diǎn)特征進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2017年經(jīng)傳統(tǒng)固體培養(yǎng)，并經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株共505例。

1.2 儀器與試劑

儀器：基因芯片檢測(cè)配套儀器由北京博奧生物有限公司提供。試劑：傳統(tǒng)培養(yǎng)和鑒定試劑由珠海貝索生物有限公司提供，基因芯片試劑由北京博奧生物有限公司提供。基因芯片檢測(cè)katG基因315（AGC→ACC、AGC→AAC）和inhA -15（C→T）3個(gè)突變位點(diǎn)。

1.3 方法

1.3.1 痰液化處理 將痰標(biāo)本用4%的氫氧化鈉（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接種固體培養(yǎng)基和核酸提取。

1.3.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)嚴(yán)格按《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)操作規(guī)程》的要求進(jìn)行，采用PNB和TCH進(jìn)行鑒定，并定期用H37RV進(jìn)行質(zhì)控。

1.3.3 核酸提取 煮沸法提取核酸。

1.3.4 基因芯片 核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用雜交緩沖液處理后在芯片雜交儀上進(jìn)行雜交，再用芯片洗干儀進(jìn)行洗滌和甩干，最后用芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行掃描和結(jié)果判讀，并詳細(xì)記錄判讀結(jié)果和芯片信息。

2.結(jié)果

2.1 耐藥基因突變率

共檢出105例菌株發(fā)生耐藥基因突變，突變率為20.8%（105/505），katG基因單一突變?yōu)?1例，inhA基因單一突變?yōu)?2例，katG基因和inhA基因同時(shí)突變?yōu)?例。

2.2 突變位點(diǎn)分析

katG 315（AGC→ACC）單一突變70例，katG 315（AGC→AAC）單一突變11例，inhA -15（C→T）單一突變?yōu)?2例，katG 315（AGC→ACC）聯(lián)合inhA -15（C→T）突變1例，katG 315（AGC→AAC）聯(lián)合inhA -15（C→T）突變1例。

表 耐INH MTB katG 和inhA 基因突變譜及突變頻率

3.討論

MTB耐藥性的增加，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病感染率逐年上升，加大了結(jié)核病防治的難度。許多研究表明，MTB耐藥主要是由于相關(guān)耐藥基因突變導(dǎo)致的，通過檢測(cè)相關(guān)耐藥基因是否發(fā)生突變，從而可推斷該MTB是否發(fā)生耐藥。基因芯片技術(shù)是近些年比較流行的一種基因檢測(cè)的分子技術(shù)，其通過PCR技術(shù)對(duì)待測(cè)菌的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增片段與芯片雜交，即可得到基因突變位點(diǎn)和突變類型。該法具有快速、高通量、靈敏等特點(diǎn)，近來在MTB耐藥檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，我們前期的研究[2]也驗(yàn)證了基因芯片在MTB異煙肼耐藥檢測(cè)中具有較好的應(yīng)用效能。

研究表明，MTB對(duì)異煙肼耐藥主要是由katG、inhA、ndh、kasA、ah-pC五種基因引起，以katG、inhA突變較為常見，超過80%的耐藥由這兩個(gè)基因突變引起[3]。博奧基因芯片基于上述研究，只檢測(cè)五種基因中的katG、inhA，可檢出大部分耐INH的MTB。多數(shù)研究數(shù)據(jù)表明不同地區(qū)的臨床分離MTB異煙肼耐藥基因突變頻率存在差異[4]。katG基因編碼過氧化氫一過氧化物酶，其可使INH活化為異煙酸，使MTB不能合成胞壁枝菌酸，破壞MTB的保護(hù)屏障[5]。katG基因突變后導(dǎo)致INH無法活化為異煙酸，從而導(dǎo)致MTB對(duì)INH耐藥。InhA基因編碼的烯酸基還原酶是INH作用靶點(diǎn)，活化的INH能與InhA酶相結(jié)合，阻礙分枝菌酸合成，干擾長(zhǎng)鏈脂肪酸的縮合。InhA基因的點(diǎn)突變和缺失造成inhA高度表達(dá)，至所需INH濃度增高導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[6]。505例菌株共檢出105例基因發(fā)生突變，以katG突變?yōu)橹饕蛔冾愋停蛔冾l率達(dá)79%（83/105）。與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道相近[7，8]，但與西班牙的34.6%、俄羅斯的93.6%、香港的51%[9]存在一定的差距，這也證明了MTB耐藥基因的突變存在明顯的地區(qū)差異。本研究中，katG 315（AGC→ACC）為最常見突變，突變頻率為67.6%（71/105），與2015年的突變頻率69.2%相近，可以認(rèn)為katG 315位點(diǎn)（AGC→ACC）突變?yōu)楸镜貐^(qū)最常見突變。24例檢測(cè)到InhA基因突變，突變頻率為22.5%，與吳雪瓊[10]和歐維正等人的結(jié)果相近，與朱中元[11]的結(jié)果差異較大，但需要注意的是，InhA基因突變往往只引起低水平耐藥。

本研究中，發(fā)現(xiàn)兩例菌株發(fā)生katG 315和inhA -15聯(lián)合突變，聯(lián)合突變往往被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致高水耐藥。有兩例未能檢測(cè)到katG基因315位點(diǎn)，存在katG基因缺失，過去的研究認(rèn)為基因缺失也會(huì)導(dǎo)致耐藥，但需要更多的研究來驗(yàn)證。

綜上所述，本地區(qū)MTB對(duì)異煙肼耐藥基因突變中katG 315（AGC→ACC）為最主要突變，inhA -15（C→T）次之。