苦參堿誘導人結腸癌Caco-2細胞周期阻滯的作用機制研究

王丹 肖凌 江紹偉

（1中國人民解放軍第一六一醫院 湖北 武漢 430000）

（2湖北中醫藥大學檢驗學院 湖北 武漢 430065）

結腸癌的發病率以及死亡率是我國惡性腫瘤的第三位，治療手段主要以手術切除為主，同時聯合化療、放療來降低復發率，提高生存率。結腸癌的化療毒副作用大。中藥有高效低毒的特點，近年來在腫瘤的后期治療中起到一定的作用[1]。苦參堿是中藥苦參的主要活性成分之一，近年來發現其能夠誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖而發揮抗腫瘤作用。本實驗主要研究MA對人結腸癌Caco-2細胞的致凋亡作用，探討其對結腸癌可能的作用機制，為中藥在腫瘤治療方面的應用提供一定的理論依據。

1.材料與方法

1.1 材料與試劑

人結腸癌Caco-2細胞由湖北省腫瘤醫院實驗中心提供。苦參堿購自Sigma公司，用RPM1640（美國Gibco公司）助溶，終濃度為200mg/ml，0.22濾器除菌，-20℃保存，臨用時加培養液稀釋至所需濃度；二甲基亞砜（DMSO）﹑噻唑藍（MTT）為南京凱基公司產品；其他試劑購自廣州瑞博公司。

1.2 細胞培養和MTT測定

結腸癌細胞Caco-2常規培養于RPMI 1640培養基（含10%的小牛血清），置37℃、5% CO2孵箱內靜置培養 。取對數生長期的細胞，采用0.25%胰酶消化后，將細胞密度調整為l×l05/ml。以每孔200μL接種于微孔板，分別加入苦參堿，終質量濃度分別為2、4、8、16和32mg/ml，每組設3個復孔，分別培養24，36和48小時，對照組僅加等量的培養液。每孔加 MTT（5g/L）20μl，培養4h后，棄去培養基，加150mL的DMSO溶液，輕輕振蕩約10min后，酶標儀于490nm波長處 測吸光度（A），根據公式（細胞增殖率=A實驗組／A對照組）計算細胞增殖率。

1.3 有絲分裂

有絲分裂評估細胞死亡率，將不同濃度苦參堿的細胞懸液（1×105個細胞）與磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）在4℃下混合，12000轉/分離心5分鐘。70%乙醇溶液重懸浮，4℃溫育過夜。收集上清液細胞，室溫下重懸于500μLPI溶液（含有0.2% Triton X-100的PBS，50μg/ml的PI和100μg/ml的RNase A）。30分鐘后，采用Cell Quest軟件，使用流式細胞術測定有絲分裂狀態。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡

以4、8、16mg/ml MA處理人結腸癌Caco-2細胞24h，分別消化收集各組細胞，調整細胞濃度至1×106/ml，4℃ PBS洗滌兩次后，棄上清液；加入預冷的結合緩沖液100μl重懸細胞，置冰浴；加入10μl annexin V-FITC和10μl20μg/ml PI于細胞懸液中，輕輕混勻；將試管置于室溫避光染色15min；補加400μl結合緩沖液混懸細胞，流式細胞儀進行檢測、分析細胞凋亡的百分比。

1.5 Western印跡檢測細胞色素c水平

培養細胞經PBS處理，用含有10mM Tris-HCl（pH7.5），10mM NaCl，175mM蔗糖和12.5mM EDTA的緩沖液中超聲處理細胞來分離線粒體和細胞質，將細胞提取物以1000×g離心10分鐘棄沉淀，轉移上清再以18000轉/分離心30分鐘，所得上清即作胞質部分和對應所得的沉淀即為胞質對應的粗制線粒體部分。通過Bradford方法在兩個級分中測量蛋白質含量。通過15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離等量的蛋白質，并電轉移至NC膜上。NC膜以封閉液室溫孵育3h后，取出放入一抗工作液中孵育，4℃過夜，以TBST洗膜（5min×3次）后，放入AP標記的二抗工作液中孵育，室溫2h，再以TBST洗膜（3min×5次），然后水洗，并放入以BBT/BCIP試劑盒新鮮配制AP顯色液中顯色，流水洗滌終止顯色，掃描NC膜上顯色條帶，并采用Quantity One軟件分析。

1.6 蛋白質印跡分析

采用分光光度法檢測人結腸癌Caco-2細胞caspase-3，-9酶活性，以4、8、16mg/ml MA，作用細胞24h后收集各組細胞，按caspase-3，-9檢測試劑盒說明書操作。酶標儀在λ=405nm測定其光密度（D）值。用D實驗組/D對照組的比值表示caspase活化程度。

1.7 Western Blot檢測凋亡相關蛋白Bax及Bcl-2的表達

將細胞經不同濃度的MA處理24h后，消化并收集細胞，加入細胞裂解液100μl后，經4℃ 12000rpm離心10min。將等量樣品（30μg/ml）經12.5% SDS–PAGE膠分離蛋白質并轉到硝酸纖維膜上。先加入一抗工作液過夜，再加入二抗工作液。洗膜加ECL化學顯影劑，X光片曝光顯結果。

1.8 統計學方法

采用用SPSS13.0統計分析軟件進行方差分析，統計方法采用方差分析和t檢驗，P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 Matrine 對Caco-2 Cells細胞增殖的抑制作用

2mg/ml苦參堿作用Caco-2 Cells細胞24、36、48小時細胞增殖率分別為9.8%，19%，28%；4 mg/ml時分別為11%，35%，50%；8mg/ml時分別為32%，49%，60%；8 mg/ml時分別為38%，49%，61%，16mg/ml時分別為52%60%，68%；32mg/ml時分別為58%，68%，75%；不同濃度Matrine 對Caco-2 Cells細胞增殖均有不同程度地抑制，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

2.2 流式細胞儀分析Martine 對細胞周期的影響

如圖1所示，隨著濃度地增加細胞在G0/G1期明顯增加，在G2/M期顯著降低，這一結果表明苦參堿阻滯G0/G1期Caco-2細胞，S和G2/M期細胞減少。

圖1

2.3 凋亡檢測

因本研究使用PI的組織化學分析來分離凋亡的初始階段與壞死。在用FACScan流式細胞儀測試了不同階段的細胞比例，包括活細胞死亡或凋亡相。結果如圖2所示。活體細胞在左下象限（不含膜聯蛋白V-FITC和PI染色）中鑒定。早期的細胞在右下象限（Annexin V-FITC陽性）中發現。晚期凋亡的特征在于膜和核泡沫的存在，并且在該階段的細胞在右上象限中發現（膜聯蛋白V-FITC和PI的雙染色）。結果表明隨著苦參堿劑量的增加，早期和晚期凋亡增加。晚期凋亡細胞的比例高于早期凋亡細胞的比例。

圖2

2.4 細胞色素c釋放

細胞凋亡刺激引發線粒體釋放細胞色素c進入胞質溶膠。蛋白質印跡分析顯示細胞質中的細胞色素c含量增加（圖3）。

圖3

2.5 Bax和Bcl-2表達水平

Western印跡結果表明，在4至16mg/ml的劑量范圍內，Bcl-2表達下調和Bax水平增強，Bcl-2/Bax比例降低（圖3）。

2.6 上調caspase-9和-3

胱天蛋白酶是介導凋亡致死階段的半胱氨酸蛋白酶。苦參堿能夠增強其前體活化的半胱天冬酶-9和-3的產生（圖4）。

圖4

3.討論

在本研究中，使用結腸癌細胞系在體外建立苦參堿的抗癌作用，如MTT測定所示，采用2～32mg/ml苦參堿時，Caco-2細胞的生長以劑量依賴性方式被阻斷。流式細胞術分析顯示Caco-2細胞在G0/G1期生長停滯，S期和G2-M期細胞減少。

細胞凋亡不僅介導正常生理，還介導多種疾病的病理生理。凋亡和增殖不平衡導致腫瘤發展和進展[2]。促凋亡特性Bcl-2組蛋白，包括其他成員中的抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bax，調節細胞生長和增殖[3]。Bcl-2抑制細胞色素c的分泌，而不破壞外線粒體膜。Bax促進細胞色素c釋放。在本研究中，苦參堿治療下調Bcl-2和上調Bax，從而增加線粒體膜的通透性。免疫印跡顯示苦參堿通過調節Bax和Bcl-2的表達水平來干擾體外結腸癌細胞。

胱天蛋白酶介導凋亡的致死階段。外因和內在信號通路分別由caspases-8和-9誘導。通過線粒體蛋白簇切除Procaspase-8。此外，胱天蛋白酶-3作為關鍵酶涉及凋亡，已知通過DNA修復分子的切割誘導凋亡，抗凋亡蛋白的降解，細胞外基質的蛋白水解修飾，特異性多肽的骨架表達和其他分子。在本研究中，發現苦參堿處理誘導細胞色素c的線粒體釋放，并最終增加caspase-3的活性。半胱天冬酶-3表達為35kDa無活性的前體（procaspase-3），其被激活至17-kDa酶。凋亡的Caco-2細胞在4-16mg/ml的劑量范圍內苦參堿后顯示增加的活化的半胱天冬酶-3的水平。

本研究的結果表明，苦參堿可以預防體外人結腸癌細胞的進展。苦參堿通過降低Bcl-2/Bax比例誘導結腸癌細胞凋亡，并增加胱天蛋白酶-3和-9的活化。因此，苦參堿可用于人結腸癌輔助治療。