熒光定量PCR法在檢測嬰幼兒人巨細胞病毒感染中的臨床意義

朱旭峰 王俊玲

（山西省汾陽醫院 山西 汾陽 032200）

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是引起新生兒先天性感染的主要病原體之一[1]，并可以導致新生兒表現多種臨床癥狀，包括：新生兒黃疸消退延遲、神經運動障礙、聽力障礙、肝功能異常，貧血等[2]。多樣的臨床癥狀必須結合實驗室檢測方法進行診斷，并有效地治療HCMV感染的疾病，這對檢測方的時間的長短、結果的準確性提出更高的要求。本研究中采用熒光定量聚合酶鏈式反應法對患兒的尿液及其母乳中HCMV-DNA進行定量定性檢測，進而可以探討FQ-PCR的檢測方法對嬰幼兒HCMV感染診斷中的意義。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年7月1日至2018年6月8日在山西省汾陽醫院就診的疑似HCMV感染的患兒尿液和其母乳標本，尿液標本為54例，乳液標本為68例；年齡1d至2歲。根據兒童的年齡特點分為≥1月組，1月～1歲組，＜1歲組。

1.2 標本采集

初診次日上午用分別收集兒童的尿液及其母親的乳液送檢，不能及時送檢的樣本暫時放在4℃冰箱保存，采集過程中必須用無菌離心管。

1.3 儀器與試劑

檢測使用儀器是美國ABI7500型熒光定量PCR儀，試劑為達安基因股份有限公司的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光法，Cat：#DA-d061）。

1.4 檢測方法

嚴格按照熒光定量PCR檢測HCMV-DNA按試劑說明書操作。分別取乳液和尿液1ml存于配套的無菌離心管中，在轉速為12000r/min的條件下，離心5min后，去上清，向沉淀中加DNA提取液50μL混勻后置于100℃水浴10min，同樣轉速下離心5min后取5μL做模板進行相應的定量PCR擴增。

分別取5μL處理后的標準品（包括陽性，弱陽性，陰性標準品）和標本DNA模板于PCR管中，放入PCR儀器樣品槽中并根據試劑說明書實驗條件進行反應：93℃ 2min，93℃ 45s→55℃60s→10個循環，93℃ 30s→55℃ 45s→30個循環，反應結束后分析計算定量結果。

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行分析。采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.001為差異有顯著統計學意義。

2.結果

2.1 尿液和母乳標本的檢測陽性率比較

根據兩種標本的陽性檢出率的比較，差異具有顯著統計學意義（χ2=36.27，P＜0.0001），見表1。

表1 尿液和母乳標本中HCMV-DNA FQ-PCR檢測結果

2.2 配比檢測結果對比

結果發現：尿液陽性率分別為17.8%（8/45），而母乳的陽性率為68.9%（31/45）（表2）；兩者差異有統計學意義（χ2=4.39，P＜0.05）。

表245例尿液和母乳標本HCMV-DNA FQ-PCR配對檢測結果

3.討論

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）屬于皰疹病毒科，是一種DNA病毒，對宿主具有高度的種屬選擇性，而且僅在人與人之間進行傳播。HCMV的感染現象極其普遍，在我國約有95%以上的人群感染人巨細胞病毒，目前，臨床實驗室中對HCMV感染的檢測方法有很多，主要有：病毒培養、抗體檢測和抗原檢測，但其均具有一定的局限性，病毒培養檢測主要是HCMV分離，從唾液或尿液中分離病毒培養，通過普通顯微鏡觀察鑒定是否有HCMV感染。該方法操作復雜，耗時長，而且靈敏度低。抗體檢測主要對宿主血清中HCMV-IgG和HCMV-IgM進行檢測，由于我國是HCMV感染的高發地區，HCMV-IgG抗體的陽性率高于90%，根據IgG的檢測結果無法確定是否為近期感染；IgM是HCMV感染宿主后產生的，但有些免疫功能不完善的嬰幼兒在感染HCMV后產生的IgM量很少，很容易出現假陰性，因此，該檢測方法不適用于嬰幼兒早期診斷。

本結果顯示：出生時間為1月～1歲的嬰幼兒母乳檢出率和尿液檢出率相等，而出生一個月之內的嬰幼兒母乳HCMV陽性檢出率強于尿液的檢出率，通過FQ-PCR法檢測母乳中HCMV感染程度，對于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制劑的患兒有指示作用。