桄榔子醇提物對急性腹膜炎模型小鼠的改善作用及機制研究

李鳳金 王博 霍金海 黃璐琦 王偉明

中圖分類號 R284.2；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）23-3217-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.11

摘 要 目的：探討桄榔子醇提物對急性腹膜炎模型小鼠的改善作用及機制。方法：將小鼠按體質量隨機分為空白對照組（蒸餾水）、模型對照組（蒸餾水）、陽性對照組（洛索洛芬鈉片0.023 g/kg）和桄榔子醇提物高、中、低劑量組（6.5、3.25、1.625 g/kg，以提取物量計），每組24只，灌胃給予相應藥物，連續給藥3 d。末次給藥30 min后，除空白對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射酵母多糖溶液復制急性腹膜炎模型。腹腔注射酵母多糖溶液4 h內，觀察各組小鼠的活動情況、反應狀態和排泄情況；造模后每組取12只小鼠，立即尾靜脈注射伊文思藍染色液，收集腹腔灌洗液，觀察各組小鼠腹腔毛細血管的通透性；腹腔注射酵母多糖溶液4 h后每組取剩余小鼠計數腹腔灌洗液中白細胞總數，采用酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠腹腔灌洗液中炎癥因子[白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和髓過氧化物酶（MPO）]的含量。結果：與空白對照組比較，模型對照組小鼠出現明顯的扭體、腹部凹陷、蜷縮和腹瀉等現象，腹腔毛細血管通透性明顯增加（P<0.01），腹腔灌洗液中白細胞總數和IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MPO含量均明顯增加（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠上述現象僅偶有發生，腹腔毛細血管通透性明顯降低（P<0.01），腹腔灌洗液中白細胞總數和IL-1β、TNF-α含量均明顯減少（P<0.05或P<0.01），IL-10含量明顯增加（P<0.05或P<0.01），桄榔子醇提物高、中劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-6、MPO含量均明顯減少（P<0.05或P<0.01），且上述指標變化程度均與桄榔子醇提物呈劑量依賴性。結論：桄榔子醇提物對小鼠急性腹膜炎具有改善作用，其作用機制可能與降低腹腔毛細血管通透性、抑制炎癥細胞浸潤和調節腹腔中炎癥因子分泌有關。

關鍵詞 桄榔子醇提物；急性腹膜炎；炎癥因子；炎癥細胞浸潤；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the improvement effect and mechanism of ethanol extract of Arenga pinnata on acute peritonitis model mice. METHODS： The mice were randomly divided into blank control group （distilled water）， model control group （distilled water）， positive control group （Loxoprofen sodium tablets 0.023 g/kg） and ethanol extract of A. pinnata high- dose， medium-dose and low-dose groups （6.5， 3.25， 1.625 g/kg， by the amount of extract） according to body weight， with 24 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically for consecutive 3 d. 30 min after last administration， except for blank control group， other groups were given zymosan solution intraperitoneally to induce acute peritonitis model. The activity， response and excretion of mice were observed within 4 h after intraperitoneal injection of zymosan solution. 12 mice of each group were given Evans blue staining solution immediately after modeling. Peritoneal fluid was collected to observe the permeability of abdominal capillary in mice. Within 4 h after intraperitoneal injection of zymosan solution， total number of white blood cells in residual mice was counted in each group. ELISA assay was adopted to determine the contents of inflammatory factors （IL-1β， IL-6， IL-10， TNF-α， MPO）. RESULTS： Compared with blank control group， model control group suffered from significant writhing， abdominal retraction， crouch and diarrhea； peritoneal capillary permeability increased significantly （P<0.01）. The total number of leukocyte and the contents of IL-1β， IL-6， IL-10， TNF-α and MPO in peritoneal fluid were increased significantly （P<0.01）. Compared with model control group， above phenomena of mice occurred occasionally in positive control group， ethanol extract of A. pinnata high-dose， medium-dose and low-dose groups， and peritoneal capillary permeability decreased significantly （P<0.01）. Total number of leukocyte and the contents of IL-1β and TNF-α in peritoneal fluid were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while IL-10 content was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The contents of IL-6 and MPO in peritoneal fluid were decreased significantly in ethanol extract of A. pinnata high-dose and medium-dose groups （P<0.05 or P<0.01）， in dose-dependent manner. CONCLUSIONS： Ethanol extract of A. pinnata has improvement effect on acute peritonitis mice， the mechanism of which may be associated with reducing the permeability of abdominal capillaries， inhibiting inflammatory cell infiltration and regulating the secretion of inflammatory factors in abdominal cavity.

KEYWORDS Ethanol extract of Arenga pinnata； Acute peritonitis； Inflammatory factor； Inflammatory cell infiltration； Mice

桄榔[Arenga pinnata（Wurmb.） Merr.]別名姑榔、鐵木、面木，為棕櫚科桄榔屬高達常綠喬木，主要分布在我國廣東、廣西、福建、海南，云南等地及東南亞、新幾內亞和澳大利亞北部一帶[1]。桄榔子是桄榔的果實，冬季果熟時采收，是我國民間廣泛應用的傳統中藥，具有祛瘀破積、止痛的功效[2]。關于桄榔子的記載始于宋代的《開寶本草》，其中記載：“味苦，性平，無毒，主宿血”；明代的《本草匯言》也記有：“味苦，氣溫，無毒，破宿血、積血，治婦人產后兒枕血瘕諸疼”[3]。

目前，國內外文獻幾乎沒有關于桄榔子藥理活性相關的研究報道。本實驗擬通過建立酵母多糖誘導的急性腹膜炎小鼠模型，觀察桄榔子醇提物對模型小鼠行為活動、腹腔毛細血管通透性、炎性細胞浸潤和炎癥因子分泌的影響，探討桄榔子醇提物對急性腹膜炎模型小鼠的改善作用及機制，以期為其藥理活性研究、臨床應用及藥用資源的進一步開發利用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

iMarkTM全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）；320R冷凍離心機（德國Hettich公司）；XS-800i全自動血液分析儀[希森美康醫用電子（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

桄榔子新鮮果實產地為廣西北海市，于2017年7月采摘，經黑龍江省中醫藥科學院王偉明教授鑒定為真品；洛索洛芬鈉片[第一三共制藥（上海）有限公司，批號：SS032LA，規格：60 mg/片]；生理鹽水（哈爾濱三聯藥業股份有限公司，批號：161104D12）；酵母多糖（美國Sigma公司，批號：BCBT7244）；伊文思藍染色液（北京博奧拓達科技有限公司，批號：314-13-6）；小鼠白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-10、髓過氧化物酶（MPO）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司，批號：1161362712、13213- 63712、1371359712、5891321712、2411364712）。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠，♂，體質量為18～25 g，購于哈爾濱醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（黑）2013-001。所有動物實驗均經黑龍江省中醫藥科學院實驗動物倫理委員會同意后實施。

2 方法

2.1 桄榔子醇提物的制備

取桄榔子新鮮果實17.5 kg，粉碎后，加2倍量的95%乙醇浸泡24 h，10倍量的95%乙醇滲漉，收集滲漉液，60 ℃減壓回收乙醇，得提取物800 g，其中白屈菜酸鹽含量在10%～12%之間。

2.2 分組

采用隨機區組設計法，將144只ICR小鼠按照體質量分為6組：空白對照組、模型對照組、陽性對照組和桄榔子醇提物高、中、低劑量組，每組24只，

2.3 給藥與造模

陽性對照組小鼠灌胃0.023 g/kg（根據體表面積換算法，為人臨床等效劑量的2倍）的洛索洛芬鈉片；桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠分別灌胃以提取物量計為6.5、3.25、1.625 g/kg（小鼠最大耐受劑量的1/4、1/8、 1/16）的桄榔子醇提物；空白對照組和模型對照組小鼠灌胃等體積蒸餾水。每組小鼠每天給藥1次，連續給藥3 d。末次給藥30 min后，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射2 mg/mL新鮮配制的酵母多糖生理鹽水溶液，每只0.5 mL，復制急性腹膜炎小鼠模型[4]。

2.4 小鼠活動狀態觀察

腹腔注射酵母多糖后，觀察4 h內各組小鼠的活動情況、反應狀態和排便情況。

2.5 腹腔毛細血管通透性的測定

參考文獻[5]中方法測定小鼠腹腔毛細血管通透性。腹腔注射酵母多糖后，每組取12只小鼠，稱體質量后立即尾靜脈注射10 mg/mL伊文思藍生理鹽水溶液（0.1 mL/10 g），30 min后，脫頸椎處死小鼠，再腹腔注射2 mL預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS），輕輕按揉腹部2 min后，打開腹腔，吸取腹腔灌洗液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，用全自動酶標儀在590 nm波長處測定光密度（OD）。

2.6 腹腔灌洗液中白細胞計數與炎癥因子含量的測定

腹腔注射酵母多糖4 h后，將每組剩余的12只小鼠脫頸椎處死，腹腔注射3 mL預冷的PBS，輕輕按揉腹部2 min后，打開腹腔，吸取腹腔灌洗液，3 000 r/min離心10 min，用400 μL生理鹽水重懸細胞沉淀，用全自動血液分析儀計數白細胞總數；取離心上清液，采用ELISA法檢測腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MPO含量，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.7 統計學方法

所有計量數據以x±s表示，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析和組間差異性分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠活動狀態

與空白對照組比較，模型對照組小鼠均出現明顯的扭體、腹部凹陷、蜷縮和腹瀉現象，說明有腹部炎癥反應發生，表明急性腹膜炎小鼠模型造模成功。與模型對照組比較，陽性對照組和桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠雖活動緩慢，但扭體、腹部凹陷、蜷縮和腹瀉現象僅偶有發生。

3.2 各組小鼠腹腔毛細血管通透性測定

與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹腔灌洗液OD值明顯增加（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠腹腔灌洗液OD值均明顯降低（P<0.01）。與桄榔子醇提物低劑量組比較，桄榔子醇提物高劑量組小鼠腹腔灌洗液OD值明顯降低（P<0.01）。模型對照組小鼠較空白對照組小鼠的腹腔毛細血管通透性明顯增加，桄榔子醇提物各劑量組小鼠較模型對照組小鼠的腹腔毛細血管通透性明顯降低，且上述指標變化程度與桄榔子醇提物呈劑量依賴性。各組小鼠腹腔毛細血管通透性的測定結果見表1。

3.3 各組小鼠腹腔灌洗液中白細胞總數測定

與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹腔灌洗液中白細胞總數明顯增加（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和桄榔子醇提物高、中、低劑量組小鼠腹腔灌洗液中白細胞總數明顯減少（P<0.01），但均高于空白對照組。桄榔子醇提物各劑量組間小鼠腹腔灌洗液中白細胞總數差異均無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠腹腔灌洗液中白細胞總數的測定結果見表2。

3.4 各組小鼠腹腔炎癥因子含量測定

與空白對照組比較，模型對照組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和MPO含量均明顯增加（P<0.01）。與模型對照組比較，陽性對照組和桄榔子醇提物高、中劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量均明顯減少（P<0.01），IL-10含量明顯增加（P<0.01）；桄榔子醇提物低劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、TNF-α含量均明顯減少（P<0.01），IL-10含量明顯增加（P<0.05），其余因子含量差異無統計學意義（P>0.05）。與桄榔子醇提物低劑量組比較，桄榔子醇提物高劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、TNF-α、MPO含量均明顯減少（P<0.01），桄榔子醇提物中劑量組小鼠腹腔灌洗液中MPO含量明顯減少（P<0.01）；桄榔子醇提物高、中劑量組小鼠腹腔灌洗液中IL-10含量明顯增加（P<0.05或P<0.01）。與桄榔子醇提物中劑量組比較，桄榔子醇提物高劑量組小鼠腹腔灌洗液中TNF-α含量明顯增加（P<0.05）。說明桄榔子醇提物各劑量組較模型對照組小鼠腹腔炎癥因子含量明顯減少，且炎癥因子含量與桄榔子醇提物呈劑量依賴性。各組小鼠腹腔灌洗液中炎癥因子含量的測定結果見表3。

4 討論

整個實驗過程中，由于實驗動物個體差異和實驗誤差，每組小鼠數量以實際為準。

炎癥反應是機體組織抵御傷害性刺激所做出的一種復雜的病理過程，包括血管舒張、毛細血管壁通透性增加、炎細胞浸潤和炎癥介質釋放等，最終可引起局部組織水腫、發熱、疼痛，甚至是組織損傷的發生[6]。酵母多糖是從酵母真菌的細胞壁中提取的多糖類成分，其腹腔注射誘發的小鼠急性腹膜炎是一種常用的急性炎癥動物模型，被廣泛用于評價抗炎藥物的抗炎活性及抗炎機制研究[7]。酵母多糖可作用于腹腔巨噬細胞Toll樣受體2（Toll like receptor 2），激活核轉錄因子κB（Nuclear factor-κB）炎癥信號傳導通路，引起炎癥因子的分泌，導致炎癥損傷，即扭體、腹部凹陷、腹瀉、蜷縮現象的發生[8]。本研究發現，模型對照組小鼠扭體、腹部凹陷、蜷縮、腹瀉現象明顯。而各給藥組小鼠雖然活動緩慢，但上述病態現象僅偶有發生，表明桄榔子醇提物對酵母多糖引起的炎性損傷具有一定的改善作用。

IL-1β是由巨噬細胞、淋巴細胞或肥大細胞產生的促炎因子，參與募集白細胞、增加毛細血管壁通透性等病理過程。此外，IL-1β還可刺激環氧合酶的表達，進而促進前列腺素的分泌，最終導致炎癥疼痛的發生[9]。TNF-а是由巨噬細胞產生的極強的內源性促炎因子，不僅可介導炎癥反應，還可通過誘導IL-1β 和IL-6的產生，加重局部炎癥反應和痛覺過敏的發生[10]。IL-6是具有廣泛活性的細胞因子，主要參與調節免疫和炎癥反應。IL-10是由淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞或肥大細胞產生的抗炎因子，可通過抑制促炎因子的產生減輕炎癥反應程度[11]。本研究發現，與模型對照組比較，桄榔子醇提物可顯著抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的產生，并促進IL-10的產生，由此表明，桄榔子醇提物抗炎作用與調節炎癥因子的分泌有關。

炎細胞浸潤是指白細胞通過遷移，聚集在炎癥病灶部位的過程，是炎癥反應最主要的特征之一[12]。腹腔注射酵母多糖誘導小鼠急性腹膜炎癥反應，可導致大量白細胞游離出血管，聚集于小鼠腹腔[13]。嗜中性粒細胞是含量最多的一種白細胞，是炎細胞浸潤最主要的白細胞。MPO存在于嗜中性粒細胞嗜天青顆粒中，其含量變化是嗜中性粒細胞浸潤功能的主要反映指標[14]。本研究發現，與模型對照組比較，桄榔子醇提物可顯著減少腹膜炎小鼠腹腔灌洗液中白細胞數量及MPO含量，表明桄榔子醇提物抗炎作用與抑制炎細胞浸潤有關。

毛細血管壁通透性變化是急性炎癥發展過程中主要的血管病理性改變，是由局部組織巨噬細胞、肥大細胞激活釋放組胺、前列腺素或白細胞三烯引起[15]。由于血管壁通透性的升高，尾靜脈注射伊文思藍染液會隨血漿滲出血管后進入到腹腔當中。因此，可通過檢測腹腔灌洗液的OD值來反映毛細血管壁通透性升高的程度。本研究發現，與模型對照組比較，桄榔子醇提物可顯著降低腹膜炎小鼠腹腔灌洗液中OD值，表明桄榔子醇提物抗炎作用與抑制毛細血管壁通透性有關。

綜上所述，桄榔子醇提物對急性腹膜炎小鼠炎性損傷具有保護作用，作用機制與降低腹腔毛細血管通透性、抑制炎細胞浸潤和調節腹腔中炎癥因子分泌有關。

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（收稿日期：2018-06-14 修回日期：2018-10-15）

（編輯：鄒麗娟）