復方降糖顆粒劑的澄清工藝優化研究

王奧昉 賴 瑛

1 杭州電子科技大學 浙江 杭州 310018

2 浙江省杭州市中醫院 浙江 杭州 310007

復方降糖顆粒劑為杭州市中醫院臨床驗方，處方由黃芩、黃連、黃芪、山楂、茯苓和葛根6味中藥組成，可適用于早期糖尿病脾虛痰濕及氣滯痰阻證型患者[1]，在降低血糖、改善糖尿病癥狀等方面有顯著的臨床療效。為了提高顆粒劑的質量、降低臨床服用量，本實驗對其殼聚糖澄清工藝進行研究，以浸膏粉吸濕性、黃芩苷和小檗堿的含量為指標，正交試驗法對殼聚糖澄清工藝進行參數優化。

1 儀器、材料與試劑

高效液相色譜儀（ST1501，HPLC）；真空干燥箱（DZF-6050，北京永光明醫療儀器廠）；電子分析天平（FA1004，上海天平儀器廠）；紫外分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司）；離心機（TGL205，長沙平凡儀器儀表有限公司）；黃芩苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110715-201117供含量測定用）；鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110713-200911供含量測定用）；殼聚糖（浙江澳興生物科技有限公司）；色譜乙腈、甲醇(色譜純，Merck Company)，其余試劑為國藥集團化學試劑公司的分析純。中藥材均從浙江中醫藥大學中藥飲片廠購買。

2 實驗方法

2.1 黃芩苷和小檗堿的含量測定：①色譜條件：色譜柱（Agilent TC-C18 250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.02M磷酸（三乙醇胺調pH至6.78）:乙腈:甲醇=（71:16:13）；檢測波長：250nm；柱溫：室溫；流速：1ml·min-1；進樣量20μl。②標準曲線的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的黃芩苷和鹽酸小檗堿對照品20.08mg、3.920mg于25ml容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，得到含黃芩苷803.2μg/ml、含鹽酸小檗堿156.8μg/ml的對照品溶液，分別取該對照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別得到含黃芩苷8.032、16.064、32.128、48.192、64.256、80.32μg/ml，含鹽酸小檗堿 1.568、3.136、6.272、9.408、12.544、15.68μg/ml的對照品溶液。照以上的色譜條件，分別精密量取各試液20μl注入液相色譜儀記錄色譜圖，見圖1（A）。設進樣濃度值為C，峰面積值為A，得黃芩苷一元線性回歸方程：C＝0.0353A－3.397，r＝0.9999，線性范圍 8.032～80.32μg·ml-1；鹽酸小檗堿一元線性回歸方程：C＝0.0155A+0.086，r＝0.9999，線性范圍1.568～15.68μg/ml。③供試品溶液的制備：精密取含生藥1g/ml的藥液0.5ml，水浴蒸干后用80%乙醇15ml超聲提取3次，每次提取1小時，然后將提取液過濾，將過濾后的提取濾液蒸干，用80%乙醇溶解，定容至10ml。取1ml于5ml容量瓶中定容至刻度，搖勻后再用0.45μm的水性濾膜過濾即得所供試品溶液。樣品圖譜見圖1（B）。

圖1 對照品和樣品的HPLC色譜圖

2.2 精密度試驗：照上述色譜條件操作，取同一對照品溶液，連續進樣測定6次，測得黃芩苷峰面積的相對標準偏差(RSD)為1.64%，小檗堿峰面積的RSD為1.71%。

2.3 重復性試驗：精密吸取同一批次的樣品6份，按“2.1”項下方法制得供試品6份，在上述相同色譜條件下測定，結果黃芩苷含量平均值為4.02mg/ml，RSD為2.29%；小檗堿含量平均值為0.359mg/ml，RSD為2.06%。

2.4 回收率試驗：分別精密量取已知黃芩苷和小檗堿含量的同一批樣品溶液9份，每3份為一水平，分別精密加入一定量的黃芩苷和小檗堿對照品溶液（含量分別為 803.2μg/ml、156.8μg/ml）0.6、1、1.8ml，然后按“2.1”項下方法制備供試品溶液，在同一色譜條件下進行進樣測定，可得黃芩苷的平均回收率為95.45%，RSD為3.03%；小檗堿的平均回收率為83.13%，RSD為2.77%。

2.5 吸濕百分率的測定：取一定量的浸膏粉，放置于30℃烘箱中，恒重48h。用NaCl飽和溶液干燥器，48h后稱量，按如下公式計算吸濕百分率[2]。試驗做兩組，取平均值。吸濕百分率=（吸濕后重量－吸濕前重量）/吸濕前重量×100%。

2.6 正交法優選殼聚糖澄清工藝：選取殼聚糖用量、藥液濃度和溫度因素設計L9（34）正交試驗。見表1、表2。

表1 因素水平表

2.6.1 樣品制備：按照正交試驗所設計的條件，將提取液稀釋加熱后，緩慢加入殼聚糖膠體溶液，邊加邊攪拌，加完后再繼續保溫攪拌15min，然后冷卻至常溫，最后離心取上清濃縮定容至1g/ml，灌封，滅菌，即得。

2.6.2指標測定：吸濕性、黃芩苷、小檗堿，F0.05（2,2）＝19.00，自由度均為2。方差分析結果見表3。

表2L9（34）正交實驗表

表3 方差分析結果

3 結果

3.1 因素比較分析：3個因素中，對吸濕性影響最大的是C因素，最佳水平是C2；對黃芩苷影響最大的是A因素，最佳水平是A1；3種指標中B因素的3種水平無顯著性差異，直觀分析結果顯示，B因素的最佳水平均為B1。因此，A、C因素根據黃芩苷和吸濕性的方差分析結果，分別選A1和C2；C因素根據直觀分析選B1；即優選出澄清工藝條件為殼聚糖用量占生藥量的0.2%，藥液濃度為0.2g/ml，加入時的溫度為40～50℃。

3.2 優選工藝條件重復性試驗：為驗證上述優選的殼聚糖澄清工藝最佳條件的穩定性，取相同量的藥液3份，按最佳條件A1B1C2操作，平行操作，結果吸濕性、黃芩苷、小檗堿的平均值分別為22.8%、3.606mg/ml、0.274mg/ml，RSD均小于3%。

4 討論

復方降糖顆粒劑主要成分有黃芪甲苷、黃芩苷、小檗堿。黃芪甲苷由于在高效液相的紫外檢測器中響應值太低，無法檢測，因此本實驗選用了黃芩苷、小檗堿為有效成分檢測指標。殼聚糖是一種含氮陽離子堿性多糖，由于其在澄清吸附過程中較之傳統的醇沉工藝有明顯的優勢，近年來在醫藥、食品等行業得到廣泛關注[3]。本文通過正交試驗法對復方降糖顆粒的殼聚糖澄清工藝進行了優選，以吸濕性、黃芩苷、小檗堿為分析評價指標，優選出最佳澄清條件，即殼聚糖用量占生藥量的0.2%，藥液濃度0.2g/ml，溫度40～50℃，并按最佳工藝進行重復性試驗，吸濕性小，穩定性優，有效成分損失少。

5 參考文獻

[1]沈艷.唐紅運用活血化瘀法治療糖尿病經驗[J].浙江中醫雜志，2010，45（9）：640-641.

[2]王佩，劉曉昱，徐紅.復方芪苓無糖顆粒劑成型工藝的研究[J].中華中醫藥學刊,2014，32（2）：353-356.

[3]羅世江.影響殼聚糖絮凝法澄清效果因素淺析[J].中國醫藥指南，2012，10（12）：455-457.