X線相襯CT成像顯示人體膽道閉鎖樣品微脈管結構

孫夢燏，呂文娟，趙新顏，秦莉莉，胡春紅*

(1.天津醫科大學生物醫學工程與技術學院，天津 300070；2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病中心，北京 100050)

膽道閉鎖(biliary atresia, BA)是一種伴有進行性肝纖維化和肝內外膽管淤積的膽管炎性疾病，常發生于出生后3個月內嬰兒，病情嚴重時可迅速進展為膽汁性肝硬化(biliary cirrhosis, BC)，導致患兒死亡。早期診斷對BA后續治療具有重要意義，越早進行膽汁引流，術后效果越好，同時也越有利于進行肝移植手術[1]。在BA發病早期，小葉間膽管顯著增生；隨著病情發展，逐漸出現小動脈增生，并伴有動脈壁增厚，膠原大量增生，纖維化形成，最終原有膽管消失[2]。因此，分析脈管變化對診斷BA十分重要。目前研究BA的脈管結構變化通常基于肝臟組織切片，但該技術取樣面積小，存在取樣誤差，需多次取樣，且對脈管僅限于在2D層面進行觀察[3]；傳統X線、超聲、CT等臨床常用的影像學檢查技術則因存在空間和襯度分辨率較低的局限性，無法反映肝組織內的細微病理變化。X線相襯CT(phase-contrast computed tomography, PCCT)通過X線透過樣品的相位移動信息進行成像，與傳統X線吸收CT成像相比，可實現對軟組織內部結構的清晰顯像，并能夠與3D可視化技術結合，獲得高分辨率的軟組織內部3D結構圖像。隨著近年來的發展，該技術已應用于多種疾病的顯微結構分析研究[4-8]。本研究采用PCCT對離體BA組織進行成像，分析BA的脈管顯微結構變化。

1 材料與方法

1.1樣品制備 4份人體BA樣品(1～4號樣品)由首都醫科大學附屬北京友誼醫院肝病研究中心提供，本研究經醫學倫理委員會審核批準并在征得患兒家屬同意后取材。4例BA患兒均接受肝移植手術，其中男3例，女1例，分別為8、4、5和12月齡；術后離體BA樣品以磷酸緩沖液沖洗后，置于4%中性甲醛溶液中固定保存。PCCT掃描前，將樣品切成厚 5 mm、寬約6 mm的塊狀組織；考慮到成像時間較長，如樣品處于浸潤狀態，則組織內水分蒸發可引起組織變形，產生大量運動偽影，并對后續圖像校軸產生嚴重影響，難以實現微小脈管的準確成像，本研究對BA樣品進行梯度脫水，乙醇濃度分別為50%、70%、80%、95%、95%、100%和100%，每次間隔2 h，使其充分干燥，以此消除樣品變形對成像效果的影響。

1.2PCCT成像 采用上海同步輻射光源BL13W1線站進行成像實驗，成像裝置由2塊平行擺放的單色晶體、旋轉樣品臺和探測器組成，見圖1。探測器分辨力為3.25 μm，X線能量設為16 keV，探測器距離樣品25 cm，曝光時間0.5 s。PCCT掃描時，將裝有人體BA樣品的錐形管固定于樣品臺并旋轉180°，拍攝 1 080張投影圖，每間隔120張掃描2張背景圖，共采集20張背景圖，而后關閉光源，采集10張暗場圖。

圖1 PCCT成像裝置示意圖

1.3圖像處理 首先利用背景圖和暗場圖對PCCT投影圖進行校正，并以相位恢復方法對校正后圖像進行去噪處理和相位信息提取；而后采用濾波反投影算法重建，將重建獲得的圖像數據導入Amira 6.3 (FEI, Thermo Fisher Scientific, Bordeaux, France)軟件分別進行體繪制，實現人體BA樣品整體3D重建。同時，利用閾值分割和區域生長算法實現對肝動脈、膽管及增生膽管、門靜脈等脈管的區分。

1.4組織病理學檢查 完成PCCT成像實驗后3個月內，對樣品進行常規脫水和石蠟包埋，4 μm連續切片，經平滑肌細胞抗體(smooth muscle cell antibody， SMA)、細胞角蛋白19抗體(cytokeratin 19， CK19)免疫組化染色及苦味酸天狼星紅染色后，于光鏡下觀察。

2 結果

2.1PCCT投影圖 人體BA樣品PCCT投影圖見圖2。在不使用對比劑的條件下，PCCT投影圖可清晰顯示直徑為20 μm的微脈管，匯管區內可見多條脈管伴行，但大小脈管交疊，難以區分脈管類型。

圖2 人體BA樣品PCCT投影圖 1、2號樣品(A、B)肝實質中存在大量粗糙的顆粒狀結構，1～4號樣品(A～D)中匯管區均可見明顯的脈管伴行 (紅箭示脈管伴行，黃箭示顆粒狀結構)

2.2CT重建圖像與病理圖對照 人體BA樣品濾波反投影算法重建圖像及相應的病理圖見圖3。PCCT投影圖經濾波反投影算法重建后，可清晰顯示匯管區周圍密集的增生脈管的腔狀結構。人體BA樣品中，動脈形態未見明顯異常，呈現圓形或橢圓形；膽管管腔輪廓存在明顯起伏呈現波浪狀；門靜脈血管破裂，內壁組織如絮狀分布，難以觀察到其管腔結構。對比CT重建圖像及相應的SMA、CK19免疫組化染色及苦味酸天狼星紅染色病理圖，可見PCCT圖像所示匯管區脈管結構與病理圖所見相符。

2.3微脈管3D重建圖像 通過對CT重建圖像進行體繪制，獲得人體BA樣品匯管區脈管3D結構(圖4A、4B)，其中可見明顯大脈管伴行，匯管區周圍存在大量細小的新生脈管，并成環狀連接。選取420×830×240像素長方體區域(圖4A)對不同脈管類型進行區分后，分別獲得肝動脈(紅色脈管，圖4C)、膽管及增生膽管(綠色脈管，圖4D)、門靜脈(黃色脈管，圖4E)的3D結構，可見膽管增生并連接成環(圖4D)，包繞匯管區內血管束形成網狀結構，門靜脈因管壁發生破裂且受其他脈管擠壓而結構異常(圖4E)。對照相應病理圖，發現3D重建圖像所示血管及膽管結構與組織病理學所見相符。

3 討論

BA是新生兒肝內外膽道系統閉塞引起的最嚴重的消化系統疾病之一，其主要組織學特征包括小膽管增生、膽管淤積和匯管區炎性細胞浸潤，而多核巨細胞樣變、肝實質局灶性壞死和髓外造血等表征較少見[2]。膽管增生被認為是鑒別BA與其他膽汁淤積癥的高特異性及高敏感性的指標[9]。本研究通過PCCT技術對離體BA組織進行成像，同時結合3D可視化技術觀察離體BA組織內微脈管的3D結構，并基于脈管的3D結構特征對人體BA樣品中肝動脈、膽管及增生脈管、門靜脈進行區分；所得結果均與組織病理學檢查相符，提示PCCT可用于肝臟內不同類型脈管的成像；但由于PCCT成像角度與病理切片包埋角度難以完全相同，CT圖像與組織病理學檢查往往存在些許差別。

圖3 人體BA樣品PCCT濾波反投影算法重建圖像及相應病理圖 A～C.分別為第421層(A)、455層(B)及550層(C)重建圖像； D.圖A對應的SMA染色病理圖(×40)； E.圖B對應的CK19染色病理圖(×40)； F.圖C對應的苦味酸天狼星紅染色病理圖(×40) (紅箭示動脈血管；綠箭示膽管；黑箭示纖維組織)

圖4 人體BA樣品3D重建圖像 A.匯管區體繪制重建圖像； B.脈管分割整體圖像； C～E.分別為肝動脈(C)、膽管及增生膽管(D)、門靜脈(E)3D重建圖像 (白箭示增生膽管的環狀結構；紅箭示門靜脈形態異常)

有關BA組織的影像學特征研究通常基于超聲檢查，但因聲像圖空間分辨率較低，超聲醫師主要依靠膽囊形態對BA進行診斷，難以實現早期診斷，還可能出現誤診為乳肝的情況[10]。目前傳統X線、CT、超聲等臨床常用的影像學技術尚無法對<200 μm的微觀結構成像。PCCT不同于傳統CT成像技術，系根據X線穿透樣品時的相位改變信息進行成像，相位襯度變化約為吸收襯度變化的1 000倍，在生物軟組織成像方面具有優勢[11]。近年來，PCCT技術已廣泛應用于研究各種軟組織的影像學特征。Xuan等[5]應用PCCT技術對大鼠肝纖維化組織進行成像，重建后獲得3D微觀結構；通過與病理切片對照，證實PCCT技術診斷大鼠肝纖維化具有較高的敏感度、特異度及準確率。本研究發現，利用PCCT可對直徑僅為20 μm的微脈管清晰成像；對比觀察PCCT圖像與相應病理圖，發現濾波反投影算法重建圖像中門靜脈血管壁破裂，內壁成絮狀分布或堆疊在一起，原有膽管輪廓出現褶皺(圖3B、3E)；3D重建結構中也發現膽管表面出現褶皺，新生膽管連接具有明顯的成環趨勢，在門靜脈、肝動脈和原有的伴行膽管外周連接成網并與之伴行延伸(圖4D)。

本實驗屬基礎研究，仍存在一些缺陷：①采用離體樣品進行PCCT成像，需對人體BA樣品進行沖洗和干燥，難免導致脈管變形；②樣品量較少，未對微脈管進行定量分析。此外，與臨床常用的傳統X線、CT、超聲等成像技術相比，PCCT成像視野較小，僅為6 mm×5 mm，且對光源的單色性要求較高，這在一定程度上限制了其推廣應用，但目前基于常規X線管的PCCT大視野成像研究已取得一定進展[12-14]。

綜上所述，通過PCCT及其圖像后處理技術可實現對人體BA樣品中微脈管的成像，并可清晰顯示離體BA組織中肝動脈、膽管及增生膽管、門靜脈的2D和3D結構特征，同時對不同脈管進行區分。