調節性T細胞在不同分期卵巢癌患者中的臨床意義

戴 然 桑秀麗

卵巢癌致死率占婦科惡性腫瘤的首位，嚴重威脅女性生命健康。隨著免疫學的迅速發展，關于卵巢癌細胞免疫的研究，引起了學者的廣泛關注。有研究表明，卵巢癌的發生以及發展，除了與癌細胞的侵襲和惡性增殖有關外，與患者自身免疫調節功能的失衡也密切相關[1]，而淋巴細胞亞群的變化在這一過程中起重要作用。調節性T細胞(Treg)是一類T細胞亞群，具有阻止自身炎癥疾病以及免疫病發生、調控免疫應答等作用，是近年來研究的熱點[2-4]。Tregs主要指CD4+CD25+Treg[5]。大量研究顯示，多數腫瘤患者中，Treg表達水平會異常升高，患者抗腫瘤免疫功能低下，而下調CD4+CD25+Treg活性或清除，其抗腫瘤活性可顯著的增加，表明CD4+CD25+Treg的高表達抑制了患者自身抗腫瘤作用[6-8]。本研究檢測卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg水平，研究其與疾病發生、發展的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年1月至2016年12月收治的卵巢癌患者58例，年齡21～72歲，平均(55.2±12.1)歲；根據國際婦產科聯合會(FIGO)分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期6例，Ⅲ期31例，Ⅳ期16例；病理類型：黏液性癌11例，漿液性癌32例，卵巢交界性囊腺癌、腺瘤和混合癌總共15例。選取卵巢良性患者30例，年齡25～72歲，平均(53.1±10.2)歲；無免疫性疾病的健康女性35例，年齡22～71歲，平均(51.2±11.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 Calibur流式細胞分析儀(美國Becton Dickinson)；ZD-85恒溫振蕩器(中國常熟國華企業)；KDC-1042低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；加樣器(量程分別為20 μl，50 μl，100 μl等)(法國GILSON)；TECAN酶標儀(奧地利)。

1.2.2 主要試劑 鼠抗人抗體：FITC-anti-CD4，PE-anti-CD8，PE-anti-CD25， 同型對照抗體均購自美國BD公司。紅細胞裂解液。腫瘤相關抗原CA125酶免試劑(瑞典CanAg診斷試劑公司)。

1.2.3 收集標本 要求所有卵巢癌患者及健康者清晨空腹，采集其靜脈血3 ml，立即以EDTA-K2抗凝，兩者混勻。將單據號等患者信息貼在試管外壁上。

1.2.4 實驗步驟 于每試管中加入100 μl的抗凝血，之后各加入相應抗體10 μl，振蕩使之充分混勻，室溫避光孵育20 min，加入500 μl的裂解液，裂解紅細胞，振蕩使之充分混勻，暗處孵育10 min。洗滌，1 200 r/min，離心5 min，棄去上清液；加入1 ml PBS，1 200 r/min，離心5 min，棄去上清液。加入300 μl PBS混勻，待流式細胞儀檢測。

1.3 觀察指標

應用流式細胞分析儀檢測CD4+CD25+Treg在CD4+T細胞中所占百分比，CD4+CD25+Treg占全體T細胞百分比，CD4+在CD8+T細胞中所占百分比。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值對比

卵巢癌患者CD4+CD25+Treg/CD4+T 細胞的比值明顯高于健康女性和卵巢良性患者，差異均具有統計學意義(P<0.05)，卵巢良性患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T 細胞的比值與健康女性相比，差異無統計學意義(P>0.05)。健康女性、卵巢良性患者與卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+相比，差異均無統計學意義，P>0.05。見表1。

2.2 檢測FIGO分期里CD4+CD25+Treg/全體T細胞比值

卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg/全體T細胞分別為Ⅰ～Ⅱ期(17.96±4.32)、Ⅲ期(20.02±6.21)、Ⅳ期(28.73±4.21)，與國際FIGO分期呈正相關關系，分期越晚，CD4+CD25+Treg與全體T細胞的比值越高； Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ期相比，差異無統計學意義(P>0.05)，Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期患者與Ⅳ期相比，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表1 健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+，CD4+/CD8+的比較

*為與健康女性組比，P<0.05;#為與卵巢良性患者組比，P<0.05。

3 討論

Sakaguchi等在1995年發現CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)，其對機體免疫反應有著重要調控功能[9]。在生理和病理狀態下，CD4+CD25+Treg對調控機體免疫應答、維持機體免疫自穩等起著重要作用[10]。尤其在病理狀態下，許多腫瘤抗原為自身抗原，CD4+CD25+Treg增加，在維持對自身成分耐受的同時，阻止了機體對腫瘤細胞的免疫應答，導致腫瘤免疫逃逸，促進了腫瘤生長[11-13]。1999 年，Onizuka通過實驗已證實，CD4+CD25+Treg抑制了針對腫瘤的免疫應答[14]。Wolf等發現，在卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤患者腫瘤局部和外周血里，CD4+CD25+Treg的比例升高，數量同患者預后及腫瘤進展程度相關[15]。

通過流式細胞分析儀，本研究檢測了健康女性、卵巢良性患者、卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg的分布情況，結果表明，卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞的比例明顯高于卵巢良性患者及健康女性，表明卵巢癌患者外周血中Treg的功能增強。卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比例與健康女性，卵巢良性患者相比，P>0.05，差異均無統計學意義。由此推測，CD4+CD25+Treg誘導的腫瘤免疫逃逸，主要在病灶局部的微環境中發生。同時，卵巢癌患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比例低于健康女性，卵巢良性患者，表明Treg抑制CD4+等淋巴細胞的增殖、活化，限制了機體抗腫瘤免疫功能。在國際FIGO分期中，Ⅳ期卵巢癌患者外周血里CD4+CD25+Treg比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。晚期卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg數量會增加，出現這種現象，可能是調節性T細胞對腫瘤抗原刺激產生的生理性增殖或腫瘤誘導的調節性T細胞增殖。其發生的機制可能是：腫瘤細胞較少，其免疫源性足以刺激免疫應答，機體免疫監視功能可以有效地清除腫瘤細胞，相應CD4+CD25+Treg存在，腫瘤免疫應答維持在一個適度水平；當腫瘤細胞免疫源性接近正常組織或較弱，CD4+CD25+Treg發揮類似于維持自身耐受作用，保護腫瘤細胞。

綜上所述， CD4+CD25+Treg細胞格局的改變對卵巢癌的發生、發展以及分期，起著重要作用，是卵巢癌療效監測的重要指標。CD4+CD25+Treg比例升高，增殖時，會抑制機體產生有效的抗腫瘤免疫應答，從而導致腫瘤的免疫逃逸，促使腫瘤進行性生長。在卵巢癌患者的治療中，恰當地清除或者下調CD4+CD25+Treg，使之維持活化效應T細胞，有利于提高患者機體抗腫瘤免疫，抑制腫瘤生長，減輕腫瘤負荷。