山柰揮發油胃內滯留型給藥系統對胃腫瘤治療的作用機理研究

涂 云

胃腫瘤是最常見的腫瘤之一，是目前已發現的世界上最致命的腫瘤[1-2]。我國是胃癌高發地區，人口基數大，胃癌患者數不勝數，因此在胃癌診治上，目前還是不能完全滿足患者的診治需求，胃癌治療面臨著巨大的挑戰[3]。雖然近些年來腫瘤的治療已經取得一定的進步，由于胃切除后局部復發率較高，對患者而言并非最佳治療方式[4]。除此之外，胃腫瘤的預后和診斷目前還是仍相對較差[5]。山柰揮發油是1種新型的廣譜抗癌藥物，研究表明山柰揮發油能夠影響DNA合成從而干擾細胞分裂[6-8]。山柰揮發油可以延長其生存期，而且體內甲胎蛋白(AFP)表達也會下降，從而使瘤體質地變軟，體積回縮[9]。使用山奈酚和山柰揮發油后，癌灶會穩定或者縮小，還能緩解疼痛并且改善患者的進食；提高患者的免疫力，不產生骨髓抑制，治療后患者的白細胞有升高的趨勢[10-11]。胃內滯留型給藥是1種靶向治療，靶向治療是1腫瘤細胞過度表的某些分子為靶點，選擇針對性的阻斷劑，有效的調控于腫瘤發生密切相關的信號，從而達到抑制腫瘤生長，進展及轉移的效果[12]。本實驗采用體外滯留型靶向給藥方式，通過用不同劑量藥物濃度處理胃癌細胞SGC-7901，然后檢測胃癌細胞增殖、凋亡情況，并觀察經過藥物處理后胃癌細胞中COX-2和AFP的蛋白表達，從而探討山柰揮發油靶向給藥對胃癌治療的作用，為胃癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI 1640高糖培養基(杭州四季青生物工程有限公司，KGM31800S-500)；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(凱基生物有限公司，20170101)；青霉素鏈霉素混合液(索萊寶科技有限公司， 20160909)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，BI生物有限公司，1552680)；β-actin(中杉金橋，TA-09，1∶2 000)； COX-2(Cell Signaling，#12282，1∶1 000) ;AFP(abcom，ab133617，1∶50 000);迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；熒光定量PCR儀，熒光顯微鏡，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；TE2000熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞培養

SGC-7901胃癌細胞購于中國科學院上海細胞庫，當細胞的融合度達到90%以上時，棄去培養液，再用PBS洗2次，然后加入胰蛋白酶消化2 min，加入含10%FBS的1640，最后將細胞吹打下來并吸取到10 ml離心管中，離心，棄上清，注意不要碰到管口，加入1640完全培養基并接種到2個新的10 mm培養皿中，置于37 ℃，5% CO2培養箱中繼續培養。

1.3 MTT檢測

在96孔板加入細胞100 μl/孔(約2×103個)，置37 ℃5%CO2細胞培養箱培養24 h，加入山柰揮發油，然后置于37 ℃5%CO2細胞培養箱孵育48 h。將5×MTT用Dilution Buffer稀釋成1×MTT，每孔加50 μl 1×MTT，在37 ℃孵育4 h，使MTT還原為甲臢。吸出上清液，每孔加150 μl DMSO使甲臢溶解，用平板搖床搖勻。酶標儀在550 nm波長處檢測每孔的光密度。

1.4 流式檢測細胞凋亡

將細胞接種于6孔板，當細胞匯合度達到50%～70%時，在低劑量處理組和高劑量處理組中分別加入對應濃度的藥物，然后置于37 ℃5%CO2細胞培養箱。48 h后，消化收集細胞，避光染色30 min上機檢測。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.5 流式檢測細胞周期

取生長狀態良好的對數生長期的細胞，每孔按4×103個接種至12孔板中，每組設置3個復孔，置于細胞培養箱中培養，待細胞轉染和加藥物處理，繼續培養48 h后，PBS洗細胞2次，加70%乙醇固定，用流式檢測儀檢測細胞周期。

1.6 Western blot檢測

取SGC-7901細胞加入相應的裂解液，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min離心10 min，小心吸取上清，即得總蛋白。利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白變性、上樣、電泳1～2 h，濕法轉膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液過夜；室溫孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

1.7 qPCR檢測

取SGC-7901細胞進行RNA的提取，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以GAPDH為內參，算出各組組織中的COX-2、AFP表達量。引物序列如下：COX-2 F：TCAAATGAGATTGTGGGAAAATTG；COX-2 R：TCTAGTAGAGACGGACTCATAGAA；AFP F：CTGTTGCTGCCTTTGTTTGGA；AFP R：CTTCTTTGGGCTGCTCGCTAT；GAPDH F：CAATGACCCCTTCATTGACC；GAPDH R：GAGAAGCTTCCCGTTCTCAG。

1.8 統計學分析

所有數據均應用SPSS 19.0統計分析，用表示，經t檢驗顯著性差異，以P<0.05作為顯著性差異。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖

如圖1所示，與對照組相比，藥物處理組細胞增殖率明顯降低，同時，高劑量處理組相比低劑量處理組，細胞增殖率更低，有統計學差異。

圖1 MTT檢測細胞增殖

2.2 流式檢測細胞凋亡

如圖2所示，與對照組相比，藥物處理組凋亡率明顯增高，隨著藥物濃度增加，細胞凋亡率也增加。

圖2 流式檢測凋亡

2.3 流式檢測細胞周期

將低劑量和高劑量藥物分別加入細胞中，檢測對細胞周期的影響，經分析，各組G1和S所占比例皆有所變化，隨著藥物濃度的增加，G1期加長，S期縮短，G2期變化不是很顯著，見表1。

表1 流式檢測細胞周期/%

2.4 Western blot 檢測

如圖3所示，與對照組相比，低劑量藥物組和高劑量藥物組細胞中COX-2和AFP蛋白的表達都有所下調，且隨著給藥濃度升高，表達量越低，有統計學差異。

2.5 熒光PCR檢測

如圖4所示，與對照組相比，低劑量藥物組和高劑量藥物組細胞中COX-2和AFP基因的表達都有所下調，且隨著給藥濃度升高，表達量越低，有統計學差異。

3 討論

我國胃癌死亡率較高，化療是目前癌癥治療主要手段，胃切除也是在胃癌治療的1種治療手段，但是化療后便會帶來食欲缺乏、毛發脫落和血細胞減少等副作用，而胃切除則因復發率較高而不能被廣泛使用。若使用普通抗癌藥，用藥后全身分布，也有較大的毒副作用。為解決癌癥治療中這一系列問題，近年來，使用天然產物藥物被認為是預防和治療癌癥疾病的新型治療策略。山奈酚和山柰揮發油是1種存在于不同植物物種中的天然黃酮醇，被認為具有抗炎性質，許多植物性食品和草藥中皆含有這些成分[13]。此外，多項研究表明，山柰酚和山柰揮發油可以抑制人類癌細胞株的生長和誘導細胞凋亡[14]。本實驗通過MTT檢測胃癌細胞的存活率，結果表明，山柰揮發油能夠抑制細胞的增殖，且隨著山柰揮發油藥物濃度的升高，細胞存活率明顯降低。流式檢測細胞凋亡的結果也證實了山柰揮發油對細胞凋亡起著促進作用。流式檢測周期結果顯示，給藥后，細胞分裂受阻，滯留在S期和G2期。靶向給藥系統能將藥物定向輸送到靶器官，通過作用于體內特定的腫瘤細胞，減少了藥物對正常組織的影響，而且藥物直接作用在特定位置，減少藥效分散，因此給藥時可以降低劑量，降低了藥物的毒副作用。因此靶向治療為腫瘤患者帶來了巨大的希望[15]。本實驗以新型抗癌藥為模型，利用被動靶向的機理，直接將藥物加入胃癌細胞，研究其作為靶向治療胃癌的可行性。實驗材料易得，且無需昂貴實驗設備，便能研究目的藥物對胃癌細胞的影響。COX-2即環氧合酶2，關于乳腺癌、結腸癌等各種癌癥的研究表明，該基因和蛋白在癌細胞中都是高表達[16-17]。對照組中COX-2的表達量也證實了其在胃癌中一樣是高表達。然而在加入不同劑量的山柰揮發油藥物處理后，COX-2的表達呈現下調趨勢，與低劑量組相比，高劑量組中的COX-2表達更低。早期研究表明，甲胎蛋白(AFP)在胃癌細胞分化中起著重要作用，不含AFP的胃癌細胞相比，產生AFP的胃癌更具侵略性，侵襲作用和轉移能力更強，并表明如要抑制AFP的產生，最佳方式是個體化用藥，即本實驗中的靶向用藥[18]。本實驗通過檢測給藥組和對照組中AFP的基因和蛋白表達，PCR和Western blot兩項實驗結果皆證明，加入藥物后，AFP表達下調，尤其是高劑量藥物處理組，下調趨勢更加明顯。因此證明，山柰揮發油可以抑制AFP的產生和表達，同時也證明靶向用藥確實對AFP的產生和表達影響較大。為以后新藥研發和胃癌治療奠定了理論基礎。

綜上所述，山柰揮發油可以抑制胃癌細胞的分裂、增殖和擴散，促進胃癌細胞凋亡，并影響細胞中相關蛋白的表達。結果證實，胃癌的靶向治療，是胃癌治療的1種新的技術，是對胃癌患者有更好的康復希望。胃癌早期及時的靶向治療，對患者的康復作用很大。

圖3 Western blot 檢測COX-2、AFP表達

圖4 PCR檢測COX-2和AFP基因表達