供應商的體外診斷試劑異常質量檢測與分析

歐陽虎，李軍祥 （上海理工大學 管理學院，上海 200093）

OUYANG Hu,LI Junxiang (Management School,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

0 引言

在供應鏈管理[1]過程中，供應商的產品質量直接影響下游企業或用戶的滿意度，進而影響整個供應鏈的生存發展，特別是用于醫療方面的產品更是如此。體外診斷試劑IVD（In Vitro Diagnostics）是指按醫療器械管理的體外診斷試劑，包括在疾病的預測、預防、診斷、治療監測、預后觀察和健康狀態評價的過程中，用于人體樣本體外檢測的試劑、試劑盒、校準品、質控品等產品。可以單獨使用，也可以與儀器、器具、設備或者系統組合使用。

自21世紀來，隨著生物科技的發展，體外診斷試劑也經歷了4次技術革命：生化、酶、免疫測定、分子診斷[2]，其中分子診斷是目前最有潛力的體外診斷試劑領域之一。最早是由James Watson和Francis Crick在20世紀中期提出了DNA雙螺旋結構模型，引入了分子生物學的概念[3-4]。分子診斷主要是應用分子生物學的技術，檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出的診斷，主要技術包括核酸分子雜交、聚合酶鏈反應（PCR）、生物芯片技術和高通量測序技術等高新技術，隨著分子診斷的技術不斷成熟，在腫瘤、遺傳病、生殖等領域的篩查和診斷上逐漸普及，現階段國內IVD市場上分子診斷產品多以PCR技術特別是實時定量熒光PCR為基礎的產品。隨著實時熒光PCR技術的發展，實時熒光定量PCR技術在臨床上的應用越來越廣泛[4]。

國家政策對IVD產業的大力支持，這使得國內IVD市場增長迅速，但在高端市場上占優勢的多為外企，而大多數國內企業往往是單一產品低水平重復生產在低端市場上惡性競爭。如何提高國內IVD企業的競爭力，只有兩條路：一是保證產品質量，二是科研創新[5]。因IVD產品的特殊性，IVD生產企業必須對IVD產品質量負責，而且這不僅是生產企業的責任，也是國內執法部門和醫學界關注和研究的重點。

研究基于A公司質量部收到客戶反映某批次產品在使用過程中陽性率異常。A公司就此問題進行調查，并采用了相應的方法和對策來解決問題。通過對質量問題進行排序，運用分層分析法對問題等級進行分析，并運用魚骨圖方法重點分析質量問題，找出造成該批次產品陽性率異常的成因，對分子診斷產品生產企業和使用單位都具有比較實際的參考意義。

1 問題回溯

A公司于2016年5月、8月、11月交付S醫院某體外診斷試劑產品3個批次，每批80盒共計240盒。2017年4月收到S醫院檢驗科反映在2017年第一季度中使用A公司產品檢測后陽性率比2016年第三、第四季度陽性率統計均值高出30%，懷疑A公司交付的第三批產品有質量問題造成檢測結果假陽性的情況。S醫院決定暫停使用A公司試劑盒，并要求A公司就此開展問題調查。A公司質量部接到客戶投訴后，由管理者代表牽頭成立產品問題調查小組，立即啟動產品質量問題調查工作。

A公司從產品生產、運輸及客戶使用過程中的所有流程也就是體外診斷試劑流通環節進行數據收集和分析。本次質量調查活動采用質量管理領域常用的質量工具對問題進行分析，使用的理論工具包括：調查表法，分層法[6]，排列圖法，因果圖法。

2 問題分析方法

2.1 質量問題分類方法

本文中，主要問題是試劑盒在使用過程中陽性率異常。由于試劑盒在配制、組裝、運輸過程和客戶使用情況等因素，可能導致陽性率異常的原因復雜。包括人員的因素、設備的因素、原輔料的因素、方法的因素、操作環境的因素等，一般情況下上述因素對產品質量都有影響。審查A公司2016年5月至12月的生產記錄、質量報告，收集產品在客戶簽收前所有流程的資料，包括產品開發設計輸出資料。同時收集S醫院檢驗科反映的陽性率異常問題表現、資料和相關的數據，用以確定質量問題的程度和類別。表1列出了2016年5月至2017年4月收集到的產品與陽性率有關的質量問題。

表1 造成陽性率異常的問題表現（2016.5～2017.4）

從表1中可以看出造成產品陽性率異常的主要表現是引物探針濃度偏差、產品保存環境影響和客戶操作人員不當等。造成A公司產品陽性率異常的主要問題是引物探針濃度偏差，占到不良率的80%。引物是一小段單鏈DNA，分為上游引物和下游引物，是人工合成的兩段寡核苷酸序列，引物質量的優劣直接影響試劑盒檢測能力。探針也是一小段單鏈DNA，和引物的區別是標記有熒光集團，會和PCR擴增出的模板DNA結合，結合后可以檢測到熒光，用于試劑盒檢測樣本的定量。引物和探針的濃度偏差，會影響PCR擴增效率導致檢測樣本時出現陽性率異常。

2.2 質量問題分析方法

魚骨圖法是一種常用的尋找根本問題的方法，其最大優勢是能夠避免因人的原因造成的信息疏漏。實際工作中由于影響質量問題的因素很多，在分析問題尋找原因時難免會有遺漏，運用魚骨圖法可以幫助管理人員有條理有層次的分析，避免遺漏情況出現。A公司對問題進行識別，判定問題負責人，由問題負責人召集相關人員針對問題點，組織多次頭腦風暴從人、機、料、法、環5個層面提出問題進行分析，將收集到的原因進行分類排序分清主次繪制魚骨圖，根據魚骨圖進行分析討論判定引起質量問題的根本原因，將原因標注在圖1中。

圖1 陽性率異常原因魚骨圖

3 原因分析

將客戶反饋有問題批次的產品，該批次留樣品和其它批次留樣品進行平行試驗，根據陽性率異常情況，分別按假陽性和假陰性兩種情況進行分析。

3.1 引起假陽性的原因分析

引起假陽性的原因有很多，經過頭腦風暴后找出所有可能引起假陽性的原因，再進一步做實驗驗證原因。

3.1.1 配套耗材原因。試劑盒配套耗材主要是各種型號的離心管，查生產記錄追溯組裝問題批次的離心管，將該批次留樣品質檢后，配套耗材未污染。

3.1.2 試劑盒組份原因

（1）試劑盒由PCR反應液、酶試劑和陰陽性對照組成。試劑盒技術要求規定產品組份的質檢方法是將待檢批次的組份和合格留樣批次的組份搭配質檢。

根據質檢實驗方案將本次問題試劑盒的組份與合格批次組份設計實驗方案（見表2）。

實驗結果：問題批次的酶試劑和陰陽性對照都沒有問題，但PCR反應液與合格組份搭配質檢時，結果異常。下一步驗證對象確定為PCR反應液。

（2）由于PCR反應液是由引物、探針和緩沖液混合而成，將上述組分與合格組份混合后再進行整體質檢，并制定實驗方案（見表 3）。

表2 問題批試劑盒組份質檢方案

表3 問題批PCR反應液組份質檢方案

實驗結果：發現單獨緩沖液與合格引物、探針組合結果正常；與有問題引物和探針的組合，結果異常。下一步驗證對象確定為引物和探針。

（3）引物和探針都是人工合成的一段單鏈寡核苷酸序列，以干粉形態保存。A公司引物探針采購于某合成公司。物料入庫前質檢項目是檢查物料外包裝是否完好有無破損，檢查廠家是否提供引物和探針的合成濃度和純化方式。生產配制過程是根據廠家提供的干粉濃度，用超純水稀釋至配液需要的濃度待用。

對引物和探針進行分析，首先從引物和探針的濃度著手[7]。A公司使用Thermo的nano-drop2000型分光光度計（設備編號A-設-0032，年檢合格）檢測引物和探針的濃度在260nm和280nm波長處的吸光值來計算引物探針的濃度。將廠家提供的濃度和檢測的濃度對比后，發現兩者普遍有偏差（見表4）。

表4 引物和探針濃度對比結果，上游引物（1-8），下游引物（9-16），探針（17-24）

根據對比結果，明顯可見若按照廠家給的濃度稀釋引物和探針后，會造成上下游引物比例偏差和引物和探針的比例偏差，兩種偏差均可導致非特異性擴增導致假陽性出現[8]。引物探針的濃度偏差也會影響引物探針的穩定性，而在A公司試劑盒早期研發過程中就發現了穩定性對假陽性出現也有影響。按照自測濃度重新稀釋后的PCR反應液再質檢時，未出現假陽性結果，符合技術要求。

3.1.3 操作人員原因。在S醫院的收集問題批次產品使用情況過程中，A公司質量部人員發現在問題批次使用期間，S醫院檢驗科有安排實習生參與操作。經查證在實驗過程中因配制用耗材用盡，實習生使用了檢測室的耗材進行實驗，在整理實驗記錄時才發現。在檢測室中有大量氣溶膠存在極易造成交叉污染，導致檢測結果假陽性。

3.2 引起假陰性的原因分析，假陰性是指在檢測陽性對照品時出現陰性結果

3.2.1 設備的原因。在調查過程中發現，S醫院使用的PCR擴增儀在2017年1月28日年檢到期，恰逢過年放假直到3月份才完成年檢。年檢時發現PCR儀96孔有3個孔的溫度控制異常未按程序要求升降溫，導致在此期間使用這3個孔進行擴增實驗均失敗，檢測結果假陰性。PCR控溫是對擴增反應中的變性溫度和退火溫度的保障，反應溫度的差異直接影響擴增效果[9]。

3.2.2 環境的原因。A公司的產品保存均需在2～8°低溫保存，實際使用過程中在檢驗室操作環境在26度，且因操作人員疏忽存在試劑盒放過夜現象。超過保存溫度一定時間后會影響酶試劑的活性，酶試劑失活會導致PCR擴增失敗，檢測結果假陰性。

3.3 主要原因及應對措施

根據引起問題批次產品檢測結果陽性率異常的主要原因是外購引物和探針的濃度偏差。物料供應商為A公司合格供方，通過對其供應的21批次引物探針留樣品進行濃度檢測后，除問題批次外其他20批次引物探針濃度正常。A公司質量部發函詢問供應商，并對該供應商重啟供應商評審活動，供應商反饋因更換合成設備導致該批次合成的探針引物濃度偏差。

本次質量部就陽性率異常現象進行了質量問題匯總，并制定了相應的糾正措施（見表5）。對糾正措施進行持續關注，定期進行質量回顧。在糾正措施落實6個月后，A公司質量部經過兩次質量回顧，對新交付給S醫院的產品使用情況進行跟蹤調查，內部質檢情況正常且未收到S醫院反饋質量問題，陽性率異?，F象率為0。

表5 陽性率異常質量事故問題糾正措施

4 結論

文中用魚骨圖法研究A公司生產的體外診斷試劑產品的陽性率質量問題，找出了引起質量問題的根本原因，進而建立有效的來料質檢方案、質量控制手段和售后培訓規范，消除了外購特殊物料和最終用戶帶來的質量風險。對A公司某型產品的來料檢驗流程的可靠性和運用熒光定量PCR法的同類體外診斷試劑產品的質量控制提供了較好的經驗，獲得了S醫院的認可，保證了A公司的后續訂單業務。